一种PEG水凝胶及其制备方法以及用其制备的组织工程支架技术

本发明专利技术涉及一种PEG水凝胶，其特征在于，包含交联结构，所述交联结构由4‑arm‑PEG‑MAL与基质金属蛋白酶底物肽通过所述4‑arm‑PEG‑MAL上的马来酰亚胺基与所述基质金属蛋白酶底物肽上的SH‑基共价结合交联而成。本发明专利技术还涉及上述PEG水凝胶的制备方法，本发明专利技术还涉及上述PEG水凝胶的在制备组织工程支架中的应用，以及由其制备的组织工程支架。本发明专利技术的PEG水凝胶在低浓度的三乙醇胺缓冲液中制备而成，并且成胶时间很快，在保证基本的理化性质的前提下尽可能地降低了对其上搭载的种子细胞或药物的损害或损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程领域，更特别地，涉及一种PEG水凝胶及其制备方法以及用其制备的组织工程支架。
技术介绍
水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的聚合物，其交联网络结构中含有亲水基团或亲水链段，具有良好的生物相容性。聚乙二醇(PEG)是制备水凝胶常用高分子聚合物，PEG水凝胶具有生物相容性好、无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，在体内不会有积累，经过美国FDA认可，是非常有吸引力的潜在的组织工程支架材料。PEG水凝胶可以通过控制PEG的化学和加工条件来调整水凝胶的结构、力学行为和降解性。而PEG水凝胶的生物功能则可以通过在PEG水凝胶内部嵌入生物活性分子来获取，如嵌入基质金属蛋白酶(MMP)底物肽(MMP(W)X)，使PEG水凝胶具有酶敏感性，利用种子细胞自身分泌蛋白酶(尤其MMPs)的行为，促进细胞外基质降解，促使活性分子释放，有利于种子细胞在支架上的生长、粘附。目前所报道的PEG水凝胶大多是通过Michael加成聚合或自由基引发聚合得到。自由基引发聚合的主要缺点是自由基交联会大大减少封装体内细胞生存能力，并且原位交联的水凝胶在体内的传输也是不灵便的。相比之下，Michael加成聚合避免了使用细胞毒性的自由基和紫外线，而是需要一个亲核的缓冲试剂例如三乙醇胺(TEA)或N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)来促进反应。然而，由Michael加成聚合得到的PEG水凝胶，若端基官能团为丙烯酰基(ACLT)或乙烯砜基(VS)，则需要在高浓度的亲核缓冲试剂中反应，这对一些敏感的细胞也有细胞毒性影响。因此，需要一种新的PEG水凝胶，其在制备过程中无需使用高浓度的亲核缓冲试剂来促进反应，从而使细胞毒性更低。
技术实现思路
马来酰亚胺基(MAL)因其比丙烯酰基和乙烯砜基更快的反应动力学,在生理pH值对巯基的高特异性，需要低浓度的亲核缓冲试剂，被广泛用于肽生物偶联化学。在本专利技术中，以反应活性高的马来酰亚胺功能化的四臂PEG(4-arm-PEG-MAL)为原料，以酶敏感的基质金属蛋白酶底物肽为交联剂，通过Michael加成交联，只需在低浓度TEA缓冲液中就可快速制备酶敏感性的PEG水凝胶。快速的成胶时间对3D细胞培养中封装细胞的均匀分布是至关重要的，并且允许原位成胶的保形凝胶在再生医学应用。基于此，本专利技术提供了一种PEG水凝胶，其包含交联结构，所述交联结构由4-arm-PEG-MAL与基质金属蛋白酶底物肽通过所述4-arm-PEG-MAL上的马来酰亚胺基与所述基质金属蛋白酶底物肽上的SH-基共价结合交联而成，所述4-arm-PEG-MAL的通式为其中，n为正整数，并且所述4-arm-PEG-MAL的分子量为5-20kD；所述基质金属蛋白酶底物肽的序列为Ac-GCRDGPQGIWGQDGCG-NH2，下划线标示了基质金属蛋白酶消化后底物多肽断裂位置为G与I之间的肽键，所述基质金属蛋白酶底物肽的结构式为优选地，所述交联结构与所述PEG水凝胶的质量体积比为0.05-0.1g/mL。进一步地，所述PEG水凝胶还包含吸附于所述交联结构上的液体介质，所述液体介质为水、生理盐溶液或三乙醇胺缓冲液。本专利技术还提供了上述PEG水凝胶的制备方法，包括以下步骤：S1：将4-arm-PEG-MAL和基质金属蛋白酶底物肽溶解于pH7.4的三乙醇胺缓冲液中，得到预成胶溶液；S2：将所述预成胶溶液转移至模具中，于37℃下交联5-20min，形成所述PEG水凝胶，所述4-arm-PEG-MAL的通式为其中，n为正整数，并且所述4-arm-PEG-MAL的分子量为5-20kD；所述基质金属蛋白酶底物肽的序列为Ac-GCRDGPQGIWGQDGCG-NH2，结构式为优选地，所述三乙醇胺缓冲液的三乙醇胺浓度为3-10mM。优选地，溶解于所述三乙醇胺溶液中的4-arm-PEG-MAL与基质金属蛋白酶底物肽的量使所述4-arm-PEG-MAL的MAL与所述基质金属蛋白酶底物肽的功能基SH的比例为1:1，并且所述4-arm-PEG-MAL与所述基质金属蛋白酶底物肽的总重与所述三乙醇胺溶液的质量体积比为0.05-0.1g/mL(即，固含量为5-10％)。优选地，在S2之后还包括S3：使用液体介质置换所述PEG水凝胶中的三乙醇胺缓冲液。进一步地，所述液体介质为水、生理盐溶液或三乙醇胺缓冲液。本专利技术还提供了上述PEG水凝胶在制备组织工程支架中的用途。本专利技术还提供了一种组织工程支架，其由上述PEG水凝胶搭载活性物质而成。优选地，所述活性物质为药物或治疗用的干细胞。进一步地，所述活性物质在所述PEG水凝胶的制备过程中或制备后搭载于所述PEG水凝胶中。本专利技术的PEG水凝胶在低浓度的三乙醇胺缓冲液中制备而成，并且成胶时间很快，在保证基本的理化性质的前提下尽可能地降低了对其上搭载的种子细胞或药物的损害或损失。附图说明图1为本专利技术的PEG水凝胶的扫描电镜照片；图2为分子量20kDa下不同固含量水凝胶材料的热重曲线及微商热重曲线；图3为固含量7.5％下不同分子量水凝胶材料的热重曲线及微商热重曲线；图4为PEG水凝胶的储能模量(G’)的振荡应力扫描图谱；图5为PEG水凝胶的储能模量(G’)的动态频率扫描图谱；图6为PEG水凝胶溶胀曲线；图7为PEG水凝胶的平衡溶胀比柱状图；图8为PEG水凝胶降解率图；图9为PEG水凝胶体外细胞培养细胞增殖曲线图；图10为PEG水凝胶体外细胞培养细胞的活死细胞染色照片。具体实施方式以下结合实例和附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.PEG水凝胶的制备PEG水凝胶通过以下方法来制备：将4-arm-PEG-MAL(北京健凯科技有限公司)和基质金属蛋白酶底物肽(上海吉尔生化科技公司)溶解于3mLpH7.4的三乙醇胺中，混合均匀，得预成胶溶液；然后将上述预成胶溶液转移至5个600μl模具中，37℃生化培养箱中反应，制备得到水凝胶。制备过程中的4-arm-PEG-MAL和基质金属蛋白酶底物肽的量、4-arm-PEG-MAL的分子量、三乙醇胺浓度以及成胶时间如表1所示。表1各实施例中的参数设置上述实施例中，都能成胶，并且成胶时间都在20min以内。所得到的PEG水凝胶在扫描电镜下进行观察(图1)，结果显示，以上实施例中，在3、4和10mM的三乙醇胺下，所实验的各分子量的4-arm-PEG-MAL都能与基质金属蛋白酶底物肽交联形成多孔状的交联结构。2.PEG水凝胶的理化性质1)热稳定性将水凝胶测试样(n＝3)用超纯水充分溶胀后真空冷冻干燥，取5-10mg水凝胶样本，采用热重分析仪在氮气氛围下解析水凝胶热力学性能，3个测试样取平均值。图2为分子量20kDa下不同固含量水凝胶材料的热重曲线及微商热重曲线；图3为固含量7.5％下不同分子量水凝胶材料的热重曲线及微商热重曲线。由图2和3可看出，采用本专利技术方法制备的水凝胶材料初始分解温度均在300℃以上，具有良好的热稳定性。2)机械强度将水凝胶测试样(n＝3)用超纯水充分溶胀，滤纸擦干表面水分，采用流变仪解析水凝胶力学性能，3个测试样取平均值。图4为水凝胶材料的储能模量(G’)的振荡应力扫描图谱，图5为储能模量(G’)的动态频率扫描图谱。由图4和5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PEG水凝胶，其特征在于，包含交联结构，所述交联结构由4‑arm‑PEG‑MAL与基质金属蛋白酶底物肽通过所述4‑arm‑PEG‑MAL上的马来酰亚胺基与所述基质金属蛋白酶底物肽上的SH‑基共价结合交联而成，所述4‑arm‑PEG‑MAL的通式为其中，n地为正整数，并且所述4‑arm‑PEG‑MAL的分子量为5‑20kD；所述基质金属蛋白酶底物肽的序列为Ac‑GCRDGPQGIWGQDGCG‑NH2，结构式为

【技术特征摘要】
1.一种PEG水凝胶，其特征在于，包含交联结构，所述交联结构由4-arm-PEG-MAL与基质金属蛋白酶底物肽通过所述4-arm-PEG-MAL上的马来酰亚胺基与所述基质金属蛋白酶底物肽上的SH-基共价结合交联而成，所述4-arm-PEG-MAL的通式为其中，n地为正整数，并且所述4-arm-PEG-MAL的分子量为5-20kD；所述基质金属蛋白酶底物肽的序列为Ac-GCRDGPQGIWGQDGCG-NH2，结构式为2.如权利要求1所述的PEG水凝胶，其特征在于，还包含吸附于所述交联结构上的液体介质，所述液体介质为水、生理盐溶液或三乙醇胺缓冲液。3.如权利要求1或2所述的PEG水凝胶，其特征在于，所述交联结构与所述PEG水凝胶的质量体积比为0.05-0.1g/mL。4.一种PEG水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将4-arm-PEG-MAL和基质金属蛋白酶底物肽溶解于pH值为7.4的三乙醇胺缓冲液中，得到预成胶溶液；S2：将所述预成胶溶液转移至模具中，于37℃下交联5-20min，形成所述PEG水凝胶，所述4-arm-PEG-MAL的通式为其中，n为正整数，并且所述4-arm-PEG-MAL的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：董念国，卢翠芬，史嘉玮，乔韡华，陈思，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42