一种糜蛋白酶活力检测方法技术

本发明专利技术提供一种糜蛋白酶活力检测方法，涉及酶活检测技术领域，本发明专利技术通过在检测过程中使用含有Ca2+的反应体系和预热处理反应体系的方法，使反应体系吸光值随时间的变化呈现更加良好的线性关系，能够在反应时间内稳定糜蛋白酶的活力，检测结果重复性好，提高了糜蛋白酶的活力，降低了检测下限，灵敏度高，稳定性好，成本低，且本发明专利技术所用试剂安全无毒，可广泛应用于实验室及临床检验。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶活检测
，具体涉及一种糜蛋白酶活力检测方法。
技术介绍
糜蛋白酶是来源于牛胰经提取的蛋白水解酶。由于糜蛋白酶具有能分解蛋白、抗凝结和消炎的特性，它可用于医疗领域。糜蛋白酶能切断蛋白质肽链中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽链，因而能清创消脓，消化浓汁和坏死组织，助长新生肉芽的生长。酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈快，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。糜蛋白酶分解蛋白质、酰胺和酯中的肽键，这些肽键与芳香族氨基酸，如苯基丙氨酸、酪氨酸或色氨酸所提供的羧基团结合。糜蛋白酶已收录于中国药典，2010年版中国药典中检测糜蛋白酶活力的方法是通过在25℃恒温下水解底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯，生成在237nm紫外光下具有更低吸光值的N-乙酰-L-酪氨酸，依据吸光值的变换率计算酶活力，该方法要求在5分钟内吸光值变化率的恒定时间不得少于3分钟，在测定过程中反应体系需要精确维持25℃恒温，而市场上大多数国产紫外分光光度计没有恒温适配器，进口分光光度计具有这种装置但价格昂贵，因此很难保证恒温，对于一个酶催化反应而言，恒定的反应温度是项十分重要的参数，另外，酶自身的稳定性也是对催化反应起着至关重要的左右，而蛋白酶在水溶液中很易自我水解，因此用该法测定糜蛋白酶活力时，往往吸光值随时间变化的线性关系较差，很难维持3分钟的恒定变化率，从而使测量不精确，重复性差。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术中糜蛋白酶活力检测存在的问题，本专利技术提供一种灵敏度高、稳定性好的检测糜蛋白酶活力的方法，该方法能够在反应时间内稳定糜蛋白酶的活性并提高其活力，使反应过程中吸光值变化呈现更加良好的线性关系，结果稳定，重复性好，检测下限低，成本降低，且所用试剂安全无毒，可广泛应用于实验室及临床检验。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：S1、将底物N-乙酰-精氨酸-L-乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物液备用；S2、供试品制备：称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用4℃保存；S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为1-20mmol/L。优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为10mmol/L。优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浓度为50mmol/L。(三)有益效果本专利技术提供了一种糜蛋白酶活力检测方法，本专利技术相对于现有技术的有益效果如下：1、本专利技术通过水浴预热处理使反应体系中各反应成分处于25℃恒温环境中，有利于在普通紫外分光光度计内反应使用，降低成本；2、Tris-HCl缓冲液不与Ca2+形成沉淀，保证反应体系溶液均一稳定，利于紫外光检测，在含有Tris-HCl的碱性体系中加入Ca2+起到稳定糜蛋白酶的作用，吸光值变化恒定，同时能提高酶活力，降低检测下限，减少样品成本；3、本专利技术糜蛋白酶活力检测方法，检测过程中反应体系吸光值随时间变化的线性关系在中国药典方法基础上大大改善，检测结果重复性好，检测灵敏度高，稳定性好；4、本专利技术糜蛋白酶活力检测方法，使用的试剂无毒害，易于操作。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术检测糜蛋白酶活力吸光度时间变化的线性关系图：横坐标为反应时间，单位为s；纵坐标为吸光度值，单位为A。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：S1、将底物N-乙酰-精氨酸-L-乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物液备用；S2、供试品制备：称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用4℃保存；S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。且步骤S1中含有Ca2+的碱性缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浓度为50mmol/L，其中Ca2+浓度为1-20mmol/L。本专利技术使用的Tris-HCl缓冲液不与Ca2+形成沉淀，溶液均一，利于吸光值测定。Tris在pH8左右有较大缓冲能力，由于反应过程中不断有乙酸生成，能够维持较稳定的pH环境。通过优化发现10mmol/L可以很好的稳定和激活糜蛋白酶，在上述反应过程中，用水浴预热反应体系至25℃，使在紫外分光光度计内比色皿中的反应温度能够在一定时期内维持25℃，而加入的Ca2+可以稳定糜蛋白酶的活性，并使酶活力得到提高。具体检测过程如下：1、所用试剂及溶液配制：糜蛋白酶1200U/mg(北京智慧果公司)，酶活力单位定义：在pH7.0反应体系中，25℃反应10分钟条件下吸光度每分钟改变0.0075，既相当于1个糜蛋白酶单位；0.0012mol/L盐酸配制：用5mL移液枪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将底物N‑乙酰‑精氨酸‑L‑乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物液备用；S2、供试品制备，称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用，4℃保存；S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。

【技术特征摘要】
1.一种糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将底物N-乙酰-精氨酸-L-乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液
中，得到底物液备用；
S2、供试品制备，称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐
酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100
mL，作为供试品液备用，4℃保存；
S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置
于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于
比色皿中，置于紫外分...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋瑞，
申请(专利权)人：合肥安德生制药有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34