一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法技术方案

本发明专利技术属于生物技术与生命科学技术领域，涉及一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法。该方法通过Sp-Tomato荧光报告载体的构建、Sp-Tomato荧光报告载体导入乳腺癌细胞系、荧光信号的检测、乳腺癌肿瘤干细胞的筛选和筛选细胞的干细胞活性鉴定等步骤来实现乳腺癌和其他肿瘤干细胞的筛选，为筛选乳腺癌干细胞，进行下游的干细胞生物学特征研究提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术与生命科学
，涉及一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法。
技术介绍
在肿瘤的研究与临床治疗中，人们逐渐发现了肿瘤组织的异质性，即在实体肿瘤中，每个肿瘤细胞在功能与形态上均具有差异，而有极少一部分细胞具有干细胞活性，具有自我更新与增殖分化的潜能，是肿瘤生长的源动力，同时是现阶段肿瘤治疗后复发转移的原因，因此鉴别肿瘤干细胞，靶向杀伤肿瘤干细胞是治疗肿瘤的新方法与策略。现阶段乳腺癌干细胞的筛选方法主要采用CD44+CD24-、ALDH+和其他一些相关表面标志物进行筛选，然而研究证实这些鉴定方法筛选出来的乳腺癌肿瘤干细胞只具有极少的交集，因此目前对于乳腺癌干细胞的筛选并没有金标准，此外这些表面标志物的筛选方法，通常需要将细胞固定处理，细胞死亡后检测这些细胞其他基因的表达情况，无法进行后续的培养与相关研究。本专利技术采用干细胞的重要转录因子SOX2做为鉴定乳腺癌干细胞的指标，筛选方法不是通过固定细胞后对SOX2进行免疫荧光标记进行，而是使用间接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法，其特征在于，实现该方法的步骤是：一、Sp‑Tomato荧光报告载体的构建：1)从人类基因组中调取SOX2启动子区域：针对SOX2启动子的序列涉及调取扩增引物为：FW:5’‑GGTACCGGCCAAAGAGCTGAGTTGGA‑3’RV:5’‑AAGCTTGAGGCAAACTGGAATCAGGATC‑3’以人乳腺癌细胞系MCF‑7的基因组DNA为模板，采用保真酶进行PCR扩增，得到SOX2启动子区域，连接到T载体经测序后确定无误；2)将SOX2启动子区域插入pGL‑3basic中，并检测虫荧光素酶活性：将SOX2启动子区域从T载体酶切后连入pGL‑...

【技术特征摘要】
1.一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法，其特征在于，实现该方法的步
骤是：
一、Sp-Tomato荧光报告载体的构建：
1)从人类基因组中调取SOX2启动子区域：
针对SOX2启动子的序列涉及调取扩增引物为：
FW:5’-GGTACCGGCCAAAGAGCTGAGTTGGA-3’
RV:5’-AAGCTTGAGGCAAACTGGAATCAGGATC-3’
以人乳腺癌细胞系MCF-7的基因组DNA为模板，采用保真酶进行PCR扩增，得到SOX2启动子
区域，连接到T载体经测序后确定无误；
2)将SOX2启动子区域插入pGL-3basic中，并检测虫荧光素酶活性：
将SOX2启动子区域从T载体酶切后连入pGL-3basic虫荧光素酶活性报告载体，并转入乳腺
癌细胞系中检测其活性，虫荧光素酶活性直接反应SOX2启动子活性；
3)将虫荧光素酶的开放阅读框替换为Tomato荧光蛋白的开放阅读框：
将pGL-3basic中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁珊珊，王若雨，李伟，李贺明，王喆，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21