一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2所示。本发明专利技术的融合蛋白为溶液制剂，可用于制备抗肿瘤药物，通过局部瘤内注射的方式给药，一次性给足治疗剂量。本发明专利技术的融合蛋白中，由胶原结合结构域CBD所形成的局部的缓释系统，很好的避免了IFN‑γ扩散到周围组织所引起的强烈的免疫应答。同时无需重复多次给药，这既减少了多次给药所造成的创伤给病人带来的痛苦及反复多次用药所耗费的巨大的治疗费用，同时又降低大剂量频繁用药所引起的毒副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体涉及含有基质金属蛋白酶（MMP2）的胶原蛋白结合结构域（collagenbindingdomain,CBD）的和伽马干扰素（IFN-γ）活性结构域的重组蛋白及其融合蛋白，特别是具有多重活性的融合蛋白。
技术介绍
肿瘤是世界范围导致疾病和死亡的首要原因之一。它严重威胁着人类的健康，也引起了人们的高度关注。过去的20多年间，大量的研究聚焦在肿瘤进展中所涉及到的肿瘤的发生与信号通路之间的相关分子事件。研究发现肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂的相互作用的分子机制在肿瘤的进展中发挥了重要的作用。同时40多年的研究表明有大量的证据支持细胞外基质重塑蛋白酶如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)，是主要的癌症进展中微环境变化的调节者。MMPs也被认为是多种不同肿瘤不同发展阶段的一个潜在性的诊断和预后指标。基于MMP在肿瘤的发生发展中所起的重要作用，设计合成出能够抑制某种MMPs活性位点特异性结合并且与其它的MMPs没有一点交叉反应的抑制剂或单克隆抗体就显得相当必要。目前，MMP的多种抑制剂在实验中均表现出不同程度的抗肿瘤活性，但在临床试验中均以治疗效果不佳而宣告失败。为了尽可能地克服抑制剂设计的这个难题，就需要找到一个相关的在底物结合位点发挥作用的物质，它定位于活性位点外，却是水解过程中外部定位必须的物质分子。而大量的研究证据表明特异性的外部物质结合位点定位于催化位点之外，是基质金属蛋白酶定位水解物质分子必不可少的。因此，可以阻断外部物质介导的相互作用的物质作为高度选择性的MMP抑制剂将是较好的选择。而MMP2的CBD就正好符合上述特点。有研究报道称CBD与配体结合的相互作用的大量特征表明CBD几乎负责了MMP2与胶原结合的所有特性。而在多种病理状态下包括肿瘤、炎症、感染性疾病、脑血管疾病的退化性疾病发现明胶酶活性增加。明胶酶主要分为明胶酶A和明胶酶B，其中明胶酶A主要是指MM2，明胶酶B主要是指MMP9。虽然MMP-2和MMP-9这两个明胶酶在许多方面有共同之处，但据文献报道只有MMP2的CBD被报道能够有效的与IV型胶原结合，并能够结合一些天然和变性胶原类型，以及弹性蛋白和肝素。而且，CBD介导的结合酶底物和其它细胞外基质分子是MMP-2和细胞迁移两者发挥正常功能必不可少的要素。因此，如果能将与体内MMP2的CBD完全相同的蛋白分离出来，并置于体内胶原含量丰富且发生由MMP上调引起如肿瘤的侵袭和转移的病理状况的部位，与体内的CBD竞争性地结合相同的胶原结合位点，那么上调的MMP就不能引起相应的病理状态，在肿瘤的发生过程中就能抑制相应的侵袭和转移。而且如果此时再在局部加以细胞因子进行刺激，一方面能增强肿瘤局部的免疫应答同时又有直接杀伤肿瘤的效果，那么肿瘤的发生和转移很可能就被完全抑制了。干扰素(IFN-γ)主要由T细胞产生，结构由一段分泌肽和一个活性结构域组成，在分泌出细胞的过程中分泌肽被剪切掉，形成成熟的IFN-γ。IFN-γ具有直接抑制肿瘤细胞增殖，增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子表达，抗肿瘤血管生成等多种抗肿瘤作用。20世纪70年代起科学家开始探索干扰素的基因工程生产。1993年，美国FDA批准基因工程IFN-γ投放市场。随着国产基因工程干扰素的不断上市，在临床上的应用逐渐增多，收到了较好的疗效。但是，由于IFN-γ分子量较小，易被肾小球滤过，而临床应用时，一般是肌肉和皮下注射的方式，全身给药，而且血浆半衰期较短，需要大剂量频繁用药，如每周2～3次，而IFN-γ治疗肝炎、肿瘤、多发性硬化症、类风湿等疾病时，治疗周期常常长达数月至数年，这种长期大剂量频繁用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生毒副作用如发热（90%的病人会发生）主要是由于IFN-γ是单核／巨噬细胞的重要激活剂，它能够诱发和促进机体局部或全身强烈的炎症反应所引起的，骨髓抑制、体重减轻、厌食等，严重制约了它的应用。综上所述，MMP2可以促进肿瘤的发生和发展，但单独的MMP2的CBD可以结合细胞间质的胶原蛋白，同时可以竞争性抑制MMP2对胶原蛋白的降解；IFN-γ的活性结构域具有多重抗肿瘤活性，但也会引起严重的毒副反应。如果将这两种结构融合在一起，并且保证在融合蛋白中保持各自原有的功能和活性，这样的蛋白分子将会对肿瘤的发生、发展起到有效的抑制作用。融合蛋白的设计和实践中，面临多重技术难关，包括：1.如何精确寻找并定位到有医用价值的蛋白质功能结构域；2.不同结构域的多肽片段可能会相互影响折叠和空间结构，最终导致功能和活性的丧失，如何让两个或个结构域都能保持各自原有的功能和活性，是设计和制备多功能融合蛋白分子的关键所在；3.不同蛋白值的结构域组合起来后，在发挥各自原有的功能的基础上，如何实现功能有机组合，实现功能协同强化，优、劣势互补，从而达到卓越的治疗效果；4.正确的设计和适当的实验条件，保证融合蛋白表达出来之后具有稳定性和可溶性，且易于分离纯化。这些技术瓶颈的存在，使得多功能融合蛋白从设计、制备到应用过程中面临重重困难。本专利技术，基于大量的科学文献检索、阅读和筛选，找到两个潜在的抗肿瘤活性结构域，利用分子生物学技术设计构建融合蛋白编码序列，采用原核表达技术和蛋白亲和纯化技术表达和纯化。经过开展大量的软件合理预测和实验测试，成功设计和构建了原核表达载体，摸索出能高效表达和纯化出可溶蛋白的实验条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白。一方面，它能够发挥与细胞外基质和基底膜上的胶原蛋白结合结构域结合的作用，从而抑制肿瘤细胞分泌的MMP2的胶原结合位点与胶原的结合，起到抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用；同时又增强了肿瘤局部的IFN-γ浓度，减轻了重组IFN-γ的毒副反应。另一方面，该融合蛋白中的另一成分IFN-γ就能够被滞留在肿瘤局部，既可以发挥直接的肿瘤杀伤效应，又可以增强肿瘤局部机体的免疫应答，减少肿瘤细胞的免疫逃逸。本专利技术的另一个目的是提供编码本专利技术融合蛋白的DNA序列。包括与鼠干扰素（IFN-γ）氨基酸mat_peptide序列相同的第一区和与人MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）氨基酸mat_peptide序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与鼠IFN-γ氨基酸mat_peptide序列相同，第二区与人MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）氨基酸mat_peptide序列相同。中间未添加任何连接肽的融合蛋白。正是这样的设计思路，我们所纯化出的融合蛋白在后期的实验探究中，发现它既保留了IFN-γ的所有活性，又保留了CBD域的所有特征，是真正意义上的融合蛋白。在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达融合蛋白的基因，我们采用的是PCR法，并采用了重叠延伸PCR法。在大量获得表达融合蛋白的基因后需使用合适的载体将表达的基因转入所选载体中从而构建重组表达载体。本专利技术的另一个目的是提供携带编码本专利技术融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。本专利技术的另一个目的是提供表达本专利技术融合蛋白编码基因的宿主。本专利技术中我们选用的表达宿主为工程菌BL21。本专利技术提供的技术方案是：一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：2所示。2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子。3.根据权利要求1所述的DNA分子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，王征，李永奎，徐妞妞，张剑，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42