基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂的过氧化氢检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂的过氧化氢检测试剂盒。本发明专利技术利用铋-牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，提供了一种快速、简便、灵敏的过氧化氢检测方法。该检测方法和试剂盒所用铋-牛血清白蛋白-纳米铂制备简便。可以通过肉眼观察和测定吸光值实现对肿瘤细胞和正常细胞的区分，并且可根据吸光值计算出过氧化氢的释放量和释放速度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种新型的细胞外过氧化氢含量快速检测方法及试剂盒。其涉及一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢的检测方法，属于分析化学、纳米技术和细胞生物学领域。
技术介绍
过氧化氢是一种生命活动中非常重要的活性中间体，同时在食品生产、纸张漂白剂、消毒剂、燃料电池、酶法分析等领域如中起着重要的作用，因此对过氧化氢进行高灵敏度、高选择性的分析与检测是极为必要的。近年来的研究发现，一些肿瘤细胞如乳腺癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞等所释放的过氧化氢量远多于正常细胞，因此如何快速准确地通过检测细胞外过氧化氢的含量来识别肿瘤细胞以及检测肿瘤细胞的数量对于研究肿瘤的产生发展机制以及抗肿瘤药物作用机制有着重要的意义。酶是高效的生物催化剂，生物体内几乎所有的反应都有酶的参与。酶法分析在临床诊断、生物、食品、化学、环境等领域都有广泛的应用。酶催化反应因其具有高效、专一、条件温和等特点而备受关注。然而天然酶来源有限，提纯困难，价格昂贵，而且为了保持其活性要求实验条件和操作环境都较为苛刻，使其应用受到了极大的限制，因此模拟酶的开发及应用研究越来越受到人们的关注。本专利技术基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂的模拟过氧化物酶特性，利用过氧化氢作为电子受体参与铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶催化的显色反应，提供了一种比色检测细胞外过氧化氢的新方法及检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶活性比色检测细胞外过氧化氢的方法。为了实现上述检测方法的目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是将过氧化氢，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液混合后恒温孵育，加入0.5mol/L的硫酸终止反应，反应产物为黄色，最大吸收波长为450nm；所述的铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶由以下步骤制得：在5mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80℃下反应2h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末，在0.6mL浓度为23.8mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液和1.8mL浓度为10mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80℃下反应2.5h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂的水溶液；将铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂粉末。所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是能根据显色体系溶液颜色判断过氧化氢的浓度。所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是能根据酶标仪450nm处的吸光度以检测过氧化氢的浓度。所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是检测线性范围为0.5~30μmol/L，检测限为0.068μmol/L。所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是在96孔板中加入100μL过氧化氢溶液，10μL浓度为8mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，10μL浓度为4.76mg/mL铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液以及80μL浓度为100mmol/L，pH=5的磷酸盐缓冲液，混合后在37℃恒温孵育15min，加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸终止反应，目视观察颜色的变化或通过酶标仪测定450nm波长处的吸光度。所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是可用于测定细胞外过氧化氢浓度。具体地说，（一）铋-牛血清白蛋白-纳米铂的制备：在5mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80℃下反应2h。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在0.6mL浓度为23.8mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液和1.8mL浓度为10mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80℃下反应2.5h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂的水溶液。将铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂粉末。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。（二）过氧化氢标准曲线：在96孔板中加入100μL不同浓度的过氧化氢标准液，10μL浓度为8mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，10μL浓度为4.76mg/mL铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，80μL浓度为100mmol/L，pH=5的磷酸盐缓冲液。混合后在37℃恒温孵育15min，加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸终止反应。目视观察颜色的变化或通过酶标仪测定450nm波长处的吸光度。（三）细胞产生的过氧化氢测定方法：培养基为含6%胎牛血清的RPMI-1640，培养环境为恒温37℃的5%二氧化碳培养箱。将贴壁的细胞用胰酶消化，加培养基吹打混匀，计算细胞数量。稀释成细胞悬液之后以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。待贴壁完全之后每个细胞孔用200μL浓度为10mmol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次，去除多余的培养液以待用。在每个细胞孔中加入100μL丙二醇甲醚醋酸酯刺激之后在每个孔中加入10μL浓度为8mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，10μL浓度为4.76mg/mL的铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，80μL浓度为100mmol/L，pH=5的磷酸盐缓冲液。混合后在37℃恒温孵育15min，加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸终止反应。目视观察颜色的变化或通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是将过氧化氢，3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐，铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂水溶液混合后恒温孵育，加入0.5 mol/L的硫酸终止反应，反应产物为黄色，最大吸收波长为450 nm；所述的铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂模拟过氧化物酶由以下步骤制得：在5 mL浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 ℃下反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白‑纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白‑纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白‑纳米铂粉末，在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白‑铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL 浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 ℃下反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂的水溶液；将铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂水溶液冷冻干燥得到铋‑牛血清白蛋白‑纳米铂粉末。...

【技术特征摘要】
1.一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测方法，其特征是
将过氧化氢，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液混合后恒
温孵育，加入0.5mol/L的硫酸终止反应，反应产物为黄色，最大吸收波长为450nm；所述的
铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶由以下步骤制得：在5mL浓度为50mg/mL的牛血
清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧
化钠溶液，混匀后水浴80℃下反应2h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000
r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水
溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末，在0.6mL浓度为23.8mg/mL的牛血清白蛋
白-铂水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液和1.8mL浓度为10mmol/L，
pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80℃下反应2.5h，反应后溶液装入截止分子量为3k的
超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂的水溶液；将铋-
牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到铋-牛血清白蛋白-纳米铂粉末。
2.根据权利要求1所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检
测方法，其特征是能根据显色体系溶液颜色判断过氧化氢的浓度。
3.根据权利要求1所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检
测方法，其特征是能根据酶标仪450nm处的吸光度以检测过氧化氢的浓度。
4.根据权利要求1或3所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化
氢检测方法，其特征是检测线性范围为0.5~30μmol/L，检测限为0.068μmol/L。
5.根据权利要求1或2或3所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧
化氢检测方法，其特征是在96孔板中加入100μL过氧化氢溶液，10μL浓度为8mmol/L的
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，10μL浓度为4.76mg/mL铋-牛血清白蛋白-纳米铂水溶液
以及80μL浓度为100mmol/L，pH=5的磷酸盐缓冲液，混合后在37℃恒温孵育15min，加入
50μL浓度为0.5mol/L的硫酸终止反应，目视观察颜色的变化或通过酶标仪测定450nm
波长处的吸光度。
6.根据权利要求1或2或3所述的基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧
化氢检测方法，其特征是可用于测定细胞外过氧化氢浓度。
7.一种基于铋-牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶的过氧化氢检测试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，沈奕珉，施小琼，邓豪华，郑晓晴，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35