高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法技术

本发明专利技术公开了高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，具体方法是将由待缺基因上游片段、抗性基因片段和待缺基因下游片段组成的融合片段通过自然转移转入鸭疫里默氏杆菌，然后用所述抗性基因的抗生素筛选即获得缺失基因的鸭疫里默氏杆菌，该方法简单，将缺失基因构建融合片段后可以直接与宿主菌发生自然交换，并且培养周期短，转化率高，能够高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因，为鸭疫里默氏杆菌基因功能及减毒疫苗研制提供了工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌感染雏鸭引起的一种发病率较高的一种疾病。除造成雏鸭死亡外，也可导致饲料转化率降低、治疗成本升高等，给养鸭业造成巨大损失。目前，对于鸭疫里默氏杆菌的防治主要依赖于灭活疫苗预防和抗生素治疗。由于鸭疫里默氏杆菌存在多种血清型，且各血清型之间没有交叉保护，所以一种灭活疫苗只能针对一种血清型。同时，鸭疫里默氏杆菌对多种抗生素具有耐药性，所以抗生素治疗效果不佳且对环境污染严重。对鸭疫里默氏杆菌致病机理的研究以及新型疫苗的研发将有助于对该病的有效防控。基因缺失是一种研究基因功能及减毒疫苗的有效方法。目前，对于鸭疫里默氏杆菌基因缺失主要依赖于接合转移介导的同源重组。此种方法需要将待缺基因的上游片段、抗性片段、下游片段按顺序连接到自杀载体上。将自杀载体转入供体菌后，再通过供体菌将自杀载体转移到受体菌，最终实现同源重组。这种方法步骤繁琐、重组效率低、耗时过长等给鸭疫里默氏杆菌的研究带来诸多不便。基于此技术背景，我们专利技术了一种快速、高效的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，该方法简单，快速，高效。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，将由待缺基因上游片段、抗性基因片段和待缺基因下游片段组成的融合片段通过自然转移入鸭疫里默氏杆菌，然后用所述抗性基因的抗生素筛选即获得缺失基因的鸭疫里默氏杆菌。优选的，所述待缺基因为鸭疫里默氏杆菌基因；所述抗性基因为红霉素抗性基因。优选的，所述融合片段由以下方法制备：以鸭疫里默氏杆菌为模板，分别以SEQIDNO.1与SEQIDNO.2和SEQIDNO.3与SEQIDNO.4为引物进行PCR扩增，扩增分别获得基因上游片段和基因下游片段；然后以红霉素抗性的质粒pEP4351(参考文献)为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物进行PCR扩增，扩增获得红霉素抗性基因；再将获得的基因上游片段、基因下游片段和红霉素抗性基因进行混合并以此为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.4为引物进行PCR扩增，即获得融合片段。优选的，所述PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；再72℃后延伸10min；最后16℃保存。优选的，所述自然转移的方法如下：向含有MgCl2的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中加入融合片段，然后密封并置于37℃条件下孵育30分钟，再加入含有MgCl2的GCB培养基，于37℃条件下孵育7小时即可。优选的，所述抗生素筛选为：将菌液涂布于红霉素浓度为1μg/ml的GCB固体培养基上，然后将置于37℃条件下至单克隆长出。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，该方法简单，且具有如下优点：(1)不用构建自杀载体，也不需要供体菌，片段重组后可以直接与宿主菌发生自然交换；(2)培养周期短，一般情况下18小时就能分离到缺失株克隆；(3)敲除效率高，能筛选到阳性克隆率最高达到2.90×10-5；(4)所需成本更低。附图说明图1为基因上下同源臂及红霉素基因盒的扩增：其中，第1，3泳道为基因的上下游同源臂，理论大小均为800bp左右，PCR产物大小与预期大小相符；第2泳道为红霉素抗性基因盒ermR，理论大小约为994bp，PCR产物大小与预期大小相符。图2为融合片段制备的电泳结果，其中第1泳道表示-up，-down和ermR为模板，进行融合PCR产物条带。图3为阳性结合子的鉴定电泳结果：其中A图为扩增的抗性基因ermR，以具有红霉素抗性的质粒pEP4351为阳性对照(第9泳道)，ATCC11845野生株为阴性对照(第10泳道)，8个单克隆(第1-8泳道)；B图为扩增的目的基因，以ATCC11845野生株为阳性对照(第9泳道)，以质粒pEP4351为阴性对照(第10泳道)，8个单克隆(第1-8泳道)。具体实施方式下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本专利技术以缺失鸭疫里默氏杆菌(RAATCC11845)RA0C_1193基因为例，其它目的基因同样适用于该方法。实施例1、重组片段的构建根据NCBI报道的RAATCC11845株的RA0C_1193基因序列，具体序列如下：atgagccaaaccataaatacatcggaaagaaaagaccaaatcaaaagtgccatcatcacatttttgattagccttttggtattcttagctttgtatttttattcgtttactagagaacttccaaaggaggaagtcgtaagcacgatgctcatcaattttggagaccaaaacgagggtaacctgcctgaagaaccccaaaaccaagagggcagtctatccgccaccgaagcacctacaccaatacaagaaatacaacctacacctgtagaacctcagcccaaaaaagaagtggtaaaggagaaaattatcacagggcaaaataccaaaacaagtgctgaaaaggtggaaaaagtaacctctaaacctacaaaagaaagcacagcaaacacccaaaagaaagaaaccacgacacctaaaaaaagcagtaccactacacaaaataaaaccgtgaccaaccaaggtgatggcagaggtaacgaggctattggcaacctcatcagagggcgaggtgccaacaaaggagctcaaggaaactcccaaaacacttccggcaattcaggagacccactaggtggcgatagcaatggcgatagtaaaatcggcatagaccgaaagttaatcggatttatacctggaactatggggcgtggtggttcacagccgacccaccagtgttctgcctcaggcaccattagcatctcttatgtggtagataaagcgggcaatgtaatttcggctagacgaagtggcggtattacagacccttgtgccgtaaacacaaccatagagtgggtaaagaaatatgtaaaagcagaaagagctagcacttcttctacaggcacttacaaaatcactttctaa(SEQIDNO.1)分别设计扩增RA0C_1193基因上游(upstream)和下游(downstream)各800bp左右的引物，具体引物序列如下：upstreamp1：5’-agaaagggcttagcagaatag-3’(SEQIDNO.2)；upstreamp2：5’-cttcgtaagactggaaagtggtaagtttacttttcttgtacgg-3’(SEQIDNO.3)；downstreamp1：5’-catccttcgtagttcaaagtcgagccaaatcaataaaaggattttag-3’(SEQIDNO.4)；downstr本文档来自技高网...

【技术保护点】
高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，其特征在于：将由待缺基因上游片段、抗性基因片段和待缺基因下游片段组成的融合片段通过自然转移转入鸭疫里默氏杆菌，然后用所述抗性基因的抗生素筛选即获得缺失基因的鸭疫里默氏杆菌。

【技术特征摘要】
1.高效缺失鸭疫里默氏杆菌基因的方法，其特征在于：将由待缺基因上游片段、抗性基因片段和待缺基因下游片段组成的融合片段通过自然转移转入鸭疫里默氏杆菌，然后用所述抗性基因的抗生素筛选即获得缺失基因的鸭疫里默氏杆菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待缺基因为鸭疫里默氏杆菌基因；所述抗性基因为红霉素抗性基因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合片段由以下方法制备：以鸭疫里默氏杆菌为模板，分别以SEQIDNO.1与SEQIDNO.2和SEQIDNO.3与SEQIDNO.4为引物进行PCR扩增，扩增分别获得基因上游片段和基因下游片段；然后以红霉素抗性的质粒pEP4351为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物进行PCR扩增，扩增获得红霉素抗性基因；再将获得的基因上游片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘马峰，张利，王梦怡，程安春，汪铭书，贾仁勇，朱德康，陈舜，孙昆峰，杨乔，吴英，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51