鉴定苹果抗、感炭疽菌叶枯病的SSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提出用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，所述分子标记分别为S0607039；S0607001；S0506206；S0506078,S0506001S0405195,S0405127,S0304673,S0304011。本发明专利技术还提出扩增用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记的引物。本发明专利技术通过自行设计的SSR标记对苹果抗炭疽菌叶枯病基因进行了分子标记，确定所在的染色体位置及遗传距离，构建了紧密连锁的遗传图谱。距离抗性基因最近的分子标记能准确的鉴定出苹果对炭疽菌叶枯病的抗性，为苹果生产实践及抗性育种提供有效工具，并为下一步抗性基因的克隆及功能验证奠定了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种鉴定苹果抗感炭疽菌叶枯病的分子标记及应用，适用于苹果对炭疽菌病叶枯病的抗性鉴定，尤其是为苹果抗性育种提供早期有效的抗性预测，属于分子生物学领域。
技术介绍
苹果炭疽菌叶枯病(GlomerellaLeafSpot，GLS)是近几年在我国苹果产区新出现的一种危害严重的流行性病害，主要危害苹果叶片，造成病叶早期干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点。该病首次报导于巴西，1988年Leite等在巴西巴拿马州‘嘎啦’和‘金冠’苹果上发现了一种新型叶斑病，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerellacingulate(Leiteetal.,1988；GonzálezEetal.,1999，2003)，定名为围小丛壳叶斑病(Glomerellaleafspot,GLS)，在我国被称为炭疽菌叶枯病。在山东莱阳、江苏丰县、安徽砀山等地调查及本研究的室内接种鉴定均发现，不同苹果品种对炭疽菌叶枯病的抗性存在显著差异。国内常见的‘金冠’、‘嘎啦’、‘秦冠’和‘乔纳金’等为高感品种，‘富士’和‘红星’等为高抗品种，尤其是‘富士’在田间自然环境下几近疫免。该结论与Becker、王嶶等报道的结果相吻合(Beckeretal.,2000；王嶶等,2015)。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选苹果对炭疽菌叶枯病抗性基因的分子标记对苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。然而，目前对于苹果对炭疽菌叶枯病抗性的分子标记研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术通过自行设计的SSR标记对苹果抗炭疽菌叶枯病基因进行了分子标记，确定所在的染色体位置及遗传距离，构建了紧密连锁的遗传图谱。距离抗性基因最近的分子标记能准确的鉴定出苹果对炭疽菌叶枯病的抗性，为苹果生产实践及抗性育种提供有效工具，并为下一步抗性基因的克隆及功能验证奠定了良好的基础。其是通过以下技术方案实现的：首先本专利技术提出用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，所述分子标记包括：S0607039，含重复基序ct，产物大小为186bp；S0607001，含重复基序caggtcaggt；产物大小为269bp；S0506206，含重复基序ttggatgtg；产物长度为243bp；S0506078，含重复基序aaaagc；产物长度为304bp；S0506001，含重复基序acaaccaa；产物长度为304bp；S0405195，含重复基序tg；产物长度为258bp；S0405127，含重复基序at；产物长度为330bp；S0304673，含重复基序tg(ga)，产物长度为333bp；S0304011，含重复基序ag，产物长度为210bp。进一步的，标记S0405127与S0304673分别位于Rgls基因两侧，其遗传距离分别为0.5cM、2.3cM。进一步的，S0607039，S0607001,S0506206,S0506001,S0506078,S0405195,S0405127,S0304673,S0304011的重组率分别7.3％，6.2％，6.2％，5.6％，5.6％，4.0％，0.5％，1.6％，11.9％。本专利技术还提出扩增用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记的引物，S0607039-F和S0607039-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、2所示；S0607001-F和S0607001-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、4所示；S0506206-F和S0506206-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.5、6所示；S0506078-F和S0506078-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.7、8所示；S0506001-F和S0506001-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.9、10所示；S0405195-F和S0405195-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.11、12所示；S0405127-F和S0405127-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.13、14所示；S0304673-F和S0304673-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.15、16所示；S0304011-F和S0304011-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.17、18所示。此外，本专利技术还提出筛选所述用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记的方法，步骤如下：S1、初步筛选：从HiDRAS网站(http://www.hidras.unimi.it/)上下载了300对均匀分布于苹果17条染色体上的已发表的SSR引物在亲本及抗感池中进行初步筛选，选出在抗亲、抗池与感亲、感池中有多态性条带引物，然后在目标群体上筛选；选出与抗病基因连锁的标记CH01d08和CH05g05；S2、最终筛选：CH01d08和CH05g05被报道定位在15号连锁群上，所以抗炭疽菌叶枯病基因Rgls被定位于该连锁群上。通过与苹果基因组数据库(http://www.rosaceae.org)进行BLAST比对，将标记CH05g05和CH01d08分别定位在15号染色体2,343kb和13,699kb的位置上，连锁分析表明这两个标记分别位于Rgls基因两侧，然后根据两标记之间的序列自行设计了276对SSR引物，按照上述的方法进行筛选，最终筛选出标记S0304011，S0304673，S0405127,S0405195,S0506078,S0506001,S0607001,S0506206,S0607039。进一步的，SSR反应体系为15μL，内含10ng·μL-1基因组DNA2μL，1×MasterMix7.5μL，0.2μmol·L-1左右引物各0.8μL；其中，进行初步筛选时的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后按94℃变性30s-55℃退火40s-72℃延伸30s的程序进行10个循环，每个循环的退火温度降低0.5℃，然后按94℃变性30s-50℃退火40s-72℃延伸30s的程度进行25个循环，最后72℃延伸8min；而最终筛选的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后按94℃变性30s-相应的退火温度40s-72℃延伸30s的程序进行35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；PCR产物使用3.5％的琼脂糖凝胶电泳检验。进一步的，所述S0304011的PCR扩增使用的退火温度为56℃，S0304673PCR扩增使用的退火温度为53℃，S0405127PCR扩增使用的退火温度为55℃,S040本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括：S0607039，含重复基序ct，产物大小为186bp；S0607001，含重复基序caggtcaggt，产物大小为269bp；S0506206，含重复基序ttggatgtg，产物长度为243bp；S0506078，含重复基序aaaagc，产物长度为304bp；S0506001，含重复基序acaaccaa，产物长度为304bp；S0405195，含重复基序tg，产物长度为258bp；S0405127，含重复基序at， 产物长度为330bp;S0304673，含重复基序tg(ga)，产物长度为333bp;S0304011，含重复基序ag，产物长度为210bp。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括：
S0607039，含重复基序ct，产物大小为186bp；
S0607001，含重复基序caggtcaggt，产物大小为269bp；
S0506206，含重复基序ttggatgtg，产物长度为243bp；
S0506078，含重复基序aaaagc，产物长度为304bp；
S0506001，含重复基序acaaccaa，产物长度为304bp；
S0405195，含重复基序tg，产物长度为258bp；
S0405127，含重复基序at，产物长度为330bp;
S0304673，含重复基序tg(ga)，产物长度为333bp;
S0304011，含重复基序ag，产物长度为210bp。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，其特征在于，标记S0405127与S0304673分别位于Rgls基因两侧，其遗传距离分别为0.5cM、2.3cM。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记，其特征在于，S0607039，S0607001,S0506206,S0506001,S0506078,S0405195,S0405127,S0304673,S0304011的重组率分别7.3%，6.2%，6.2%，5.6%，5.6%，4.0%，0.5%，1.6%，11.9%。
4.扩增用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记的引物，其特征在于，
S0607039-F和S0607039-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、2所示；S0607001-F和S0607001-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、4所示；
S0506206-F和S0506206-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.5、6所示；
S0506078-F和S0506078-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.7、8所示；S0506001-F和S0506001-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.9、10所示；S0405195-F和S0405195-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.11、12所示；S0405127-F和S0405127-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.13、14所示；S0304673-F和S0304673-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.15、16所示；S0304011-F和S0304011-R核苷酸序列分别如SEQIDNo.17、18所示。
5.筛选权利要求1所述用于鉴定苹果抗炭疽菌叶枯病的SSR分子标记的方法，其特征在于，步骤如下：
S1、初步筛选：从HiDRAS网站(http://www.hidras.unimi.it/)上下载了30...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘源霞，戴洪义，祝军，张玉刚，柏素花，侯鸿敏，孙晓红，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37