基于HRP标记适体传感器的OTA化学发光检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案基于核酸适配体的高亲和性，利用OTA与报告序列竞争结合OTA适体，从而得到了待测OTA浓度与磁性微球表面报告序列固定量的负相关关系。最后通过对磁性微球表面固定的报告序列进行HPR标记，以HRP作为检测探针进行化学发光检测。利用HRP催化鲁米诺体系产生化学发光的原理，建立磁性微球表面HRP固定量与化学发光强度的对应关系，在保证检测精度的基础上拓宽了适用的OTA浓度范围。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学
，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OTA)是一种具有很强毒性的真菌毒素，其毒性在真菌毒素家族中位列第二位，仅次于黄曲霉毒素。OTA在自然界分布广泛，不仅污染谷物粮食，还严重污染动物性食品，对人类构成极大的威胁。鉴于食品安全问题关乎整个社会的安危，是受到国家及人民高度关注的大问题，建立OTA的高灵敏简便快速分析方法越发受到科研人员的重视。目前，很多基层食品检测部门较多采用薄层层析法进行OTA的定量检测，这也是较早的一种OTA的检测方法，但其存在灵敏度较差、检测周期长、所需试剂较多、重现性差等缺点，已然不能满足现阶段对OTA的检测要求。另外，常见的OTA检测方法还有高效液相色谱-荧光检测法、毛细管电泳-二极管阵列检测法、液相-质谱联用法、固相萃取荧光检测法等，但这些方法通常对样品中毒素纯度做了较高要求，且所使用的相关设备价格昂贵，故存在检测周期长、成本高等一些缺点，导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。另外，OTA作为一种小分子物质，其分子量为403.82，是典型的半抗原，故有基于OTA免疫抗体分子作为识别元件的免疫检测方法，例如免疫传感、酶联免疫法等。这些方法虽然灵敏度高、特异性好，但也存在一定的局限性，比如抗体分子制备周期长、成本较高、稳定性差、易失活及易受pH、温度等环境因素影响而变性，故在不同程度上限制了免疫方法检测OTA的开展。近年来，核酸适配体技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，以解决现有技术中OTA检测方法所适用的OTA浓度范围较窄的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中适用于较宽OTA浓度范围的OTA检测方法，其准确性较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的OTA适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-OTA适体复合物；2)向步骤1)所得的磁性微球-OTA适体复合物中先后加入待测样品和生物素化的报告序列，充分反应；3)取固相与SA-HRP溶液混合后共孵育，取固相即得到辣根过氧化酶标记的适体传感器；4)将步骤3)所述辣根过氧化酶标记的适体传感器与HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为2:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于35～39℃震荡反应50～70min。作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。作为优选，步骤2)包括以下操作：向步骤1)所得的磁性微球-OTA适体复合物中加入待测样品，于35～39℃条件下震荡50～70min，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，取固相与含有生物素化的报告序列的BA杂交液混合，在35～39℃震荡反应50～70min，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。作为优选，步骤2)中BA杂交液中生物素化的报告序列的含量为15～25pmol。作为优选，步骤2)中BA杂交液的加入量与步骤1)中氨基修饰的OTA适体用量之比为5:(1～2)(μL:pmol)。作为优选，步骤3)所述SA-HRP溶液是稀释倍数为1:10000的SA-HRP溶液。作为优选，步骤3)所述共孵育是在35～39℃条件下震荡50～70min。作为优选，在以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。在以上技术方案中，所述咪唑缓冲液可依据本领域的一般技术常识选择常规的配方配制。所述PBST缓冲液是含有137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mMKH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BA杂交液是含有20mMTris，0.5MNaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。在以上技术方案中，所述生物素化的报告序列是指序列如下所示的核酸-生物素复合物：5’-CACCCACACCCGATC-biotin-3’；该物质可自试剂销售公司定制、购得。所述氨基修饰的OTA适体是序列如下所示的核酸-氨基复合物：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-NH2-3’，该物质同样可自试剂销售公司定制、购得。步骤2)中待测样品中的OTA与生物素化的报告序列二者均与标记于磁性微球上的OTA适体具有结合作用，二者的加入量在其结合反应中满足以下条件：OTA适体相对于待测样品中的OTA过量，而待测样品中的OTA与生物素化的报告序列二者总量相对OTA适体过量，也就是说，待测样品和生物素化的报告序列与磁性微球-OTA适体混合后，待测样品中的OTA完全与OTA适体相结合，而剩余未结合的OTA适体完全与生物素化的报告序列相结合，仅剩余的生物素化的报告序列游离于体系中；具体的用量可参照本专利技术具体实施方式来确定。步骤2)所述的充分反应，是指待测样品中的OTA、生物素化的报告序列二者与磁性微球上的OTA适体之间结合反应充分。在利用本专利技术方法执行检测时，可以先利用该方法对一组具有浓度梯度且已知浓度的OTA标准溶液进行检测，以绘制出OTA浓度与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本专利技术方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。本专利技术提供了一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案以羧基磁性微球作为分离载体，在磁性微球表面构建O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的OTA适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球‑OTA适体复合物；2)向步骤1)所得的磁性微球‑OTA适体复合物中先后加入待测样品和生物素化的报告序列，充分反应；3)取固相与SA‑HRP溶液混合后共孵育，取固相即得到辣根过氧化酶标记的适体传感器；4)将步骤3)所述辣根过氧化酶标记的适体传感器与HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。

【技术特征摘要】
1.一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的OTA适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-OTA适体复合物；2)向步骤1)所得的磁性微球-OTA适体复合物中先后加入待测样品和生物素化的报告序列，充分反应；3)取固相与SA-HRP溶液混合后共孵育，取固相即得到辣根过氧化酶标记的适体传感器；4)将步骤3)所述辣根过氧化酶标记的适体传感器与HRP化学发光底物混匀，而后检测发光信号CL值。2.根据权利要求1所述的一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为2:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于35～39℃震荡反应50～70min。3.根据权利要求2所述的一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。4.根据权利要求3所述的一种基于辣根过氧化酶标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min，而...

【专利技术属性】
技术研发人员：严喜鸾，刘杰，邹宏，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36