修饰的J链制造技术

本发明专利技术涉及修饰的重组J链多肽、结合分子，如包含其的抗体；及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年4月3日提交的美国临时申请序列号61/974,738的优先权和权益，其内容以引用的方式整体并入本文。专利
本专利技术涉及修饰的重组J链多肽与结合分子，如包含其的抗体。专利技术背景J链是酸性15-kDa多肽，其经由二硫键与五聚IgM和二聚IgA相连，所述二硫键包括在IgMμ或IgAα重链的C末端处18-氨基酸分泌尾段(tp)中的倒数第二个半胱氨酸残基。在Cys12与100、Cys71与91、和Cys108与133之间分别形成三个二硫桥。参见，例如Frutiger等人1992,Biochemistry31,12643-12647。用于将J链并入到人类IgM和IgA中且用于聚合免疫球蛋白组装并与J链相连的结构要求分别由Sorensen等人2000,Int.Immunol.12(1):19-27和Yoo等人1999,J.Biol.Chem.274(47):33771-33777报道。可溶性J链在大肠杆菌中的重组产生是由Redwan等人2006,HumanAntibodies15:95-102报道。用于制造杂合IgA/IgG和IgM/IgG抗体的方法在本领域中是已知的。因此，杂合IgA2/IgG1抗体的重组产生在Chintalacharuvu等人2001,ClinImmunol101(1):21-31中报道。据报道，αtp或μtp在IgGγ重链的末端处的加入促进聚合并提高效应子功能，如补体激活(Smith等人,JImmunol1995,154:2226-2236)。IgA/IgG杂合抗体具有IgA和IgG两者的特性。尽管在抗体的设计中取得了进步，但仍然需要具有改进特性如改进的亲和力、特异性和/或亲合力的修饰抗体。随着本领域的进展，抗体功能已通过蛋白质工程的创造性手段得到提高，从而提供更高的亲和力、更长的半衰期和/或更佳的组织分布，并且通过小分子和大分子技术的组合经由毒性有效负载递送(例如抗体-药物缀合物)增强细胞破坏的集中。改善抗体功能的另一种方法利用免疫球蛋白(IgG)结构的二价结合，这允许一个IgG分子结合两种抗原。实际上，在某些应用中，不对称抗体存在良好的潜力来通过同时结合两种不同的靶抗原发挥有效功能。为了解决这个需要，已制造多种构建体来产生可结合两种不同抗原的单分子，从而允许在自然界中从未见过的功能。此双特异性方法的一个实例是“blinatumomab”(MT103或AMG103)，其分别结合T细胞和B细胞上的CD3和CD19受体。细胞毒性T细胞与癌性B细胞的此连接允许对B细胞白血病的有效治疗。然而，在双特异性抗体的构建、表达和产生中仍存在相当大的技术难度。尽管双特异性抗体由于其同时结合两种不同抗原的能力而被认为是有前景的治疗剂，但其功用因稳定性和制造复杂性的问题而受到限制。各种形式的蛋白质工程已被用于匹配异源重链，加上重链和轻链的适当成对匹配以有效地产生双特异性IgG。另外，各种双特异性抗体形式，包括四源杂交瘤、化学异缀合物、使用所选异源二聚化结构域的重组构建体以及由两个最小抗原结合位点组成的最小尺寸的重组构建体。然而，所有这些努力都充满着困难。因此，尽管致力于开发工程化的、如双特异性抗体，但仍然非常需要开发更有效的平台。这在治疗性抗体的情况下尤其正确，其中具有多重特异性的新型修饰的抗体和抗体样分子的设计和产生可缩短所述治疗剂的发现与临床引入之间的时间线。
技术实现思路
本专利技术至少部分是基于以下认识：IgM或IgA抗体的J链可通过将一个或多个结合部分引入天然的J链序列中来修饰，并且修饰的J链可被引入IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体中，而不会损害受体抗体的功能性或修饰的J链与其靶标的结合。这允许具有结合部分的修饰的J链与一组靶抗原相互作用，而IgA、IgM、IgG/IgM或IgG/IgA抗体可与不同的靶抗原组反应。本专利技术进一步基于以下认识：通过将修饰的J链导向效应细胞，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞，身体的免疫应答可被激活，并且抗体依赖性细胞毒性(ADCC)应答可得以提高。一方面，本专利技术涉及一种修饰的J链，其包含引入天然序列J链中的外来结合部分。在一个实施方案中，天然序列J链是SEQIDNO:1的天然人J链序列或其功能片段。在另一实施方案中，外来结合部分通过直接或间接融合被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。在又一实施方案中，结合部分通过经由肽接头的间接融合被引入。在一个实施方案中，间接融合是经由在结合部分的C和/或N末端处或附近的肽接头完成。在另一实施方案中，外来结合部分被引入C末端和/或N末端处或附近的SEQIDNO:1的天然人J链序列中，如距离C末端和/或N末端大约10个残基内。在又一实施方案中，外来结合部分被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中的半胱氨酸残基92与101之间。在又一实施方案中，外来结合部分在糖基化位点处或附近被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。肽接头如果存在的话，其长度可为例如约10至20个氨基酸、或约15至20个氨基酸、或15个氨基酸。在又一实施方案中，外来结合部分通过化学或化学酶促衍生化被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。化学接头可以是可裂解的或非可裂解的接头，其中可裂解的接头可为例如化学上不稳定接头或酶不稳定接头。在又一实施方案中，所述接头选自由以下组成的组：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物、活性酯、醛、双叠氮基化合物、双重氮衍生物、二异氰酸酯、以及双活性氟化合物。在一个不同的实施方案中，J链是通过插入酶识别位点并且通过将外来结合部分经由肽或非肽接头翻译后连接于酶识别位点来修饰。在所有实施方案中，外来结合部分可例如选自由以下组成的组：抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物缀合物、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、可溶性和膜结合蛋白、配体、受体、病毒样颗粒、蛋白毒素、酶、以及替代支架。替代支架的实例包括darpin、纤连蛋白结构域、adnectin及knottin。典型的抗原结合片段包括F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv及单结构域抗体。在一个优选实施方案中，抗原结合片段是scFv。在一个实施方案中，修饰的J链的外来结合部分结合至效应细胞，其中所述效应细胞可例如选自由以下组成的组：T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞及嗜中性粒细胞。在一个实施方案中，效应细胞是T细胞，其中外来结合部分可例如结合至T细胞上的CD3ε。在另一实施方案中，效应细胞是NK细胞，其中修饰的J链的外来结合部分的靶标可例如选自由以下组成的组：NK细胞上的CD16、CD64及NKG2D。在又一实施方案中，效应细胞是巨噬细胞，其中修饰的J链的外来结合部分可例如结合至巨噬细胞上的CD14。在又一实施方案中，效应细胞是嗜中性粒细胞，其中修饰的J链的外来结合部分可例如结合至嗜中性粒细胞上的CD16b或CD177。另一方面，本专利技术涉及一种包含如上所述的修饰的J链的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的J链，其包含引入天然序列J链中的外来结合部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.03 US 61/974,7381.一种修饰的J链，其包含引入天然序列J链中的外来结合部分。2.如权利要求1所述的修饰的J链，其中所述天然序列J链是SEQIDNO:1的天然人J链序列或其功能片段。3.如权利要求2所述的修饰的J链，其中所述天然序列J链是SEQIDNO:1的天然人J链序列。4.如权利要求3所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分通过直接或间接融合被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。5.如权利要求4所述的修饰的J链，其中所述结合部分通过经由肽接头的间接融合而引入。6.如权利要求5所述的修饰的J链，其中所述间接融合是通过在所述结合部分的C和/或N末端处或附近的肽接头完成。7.如权利要求6所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分在所述C末端处或附近被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。8.如权利要求7所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分在距所述C末端约10个残基内被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。9.如权利要求6所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分在所述N末端处或附近被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。10.如权利要求9所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分在距所述N末端约10个氨基酸残基内被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。11.如权利要求5所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中的半胱氨酸残基92与101之间。12.如权利要求5所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分在糖基化位点处或附近被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。13.如权利要求5所述的修饰的J链，其中所述肽接头为约10至20个氨基酸长。14.如权利要求13所述的修饰的J链，其中所述肽接头为约15至20个氨基酸长。15.如权利要求14所述的修饰的J链，其中所述肽接头为约15个氨基酸长。16.如权利要求3所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分通过化学或化学酶促衍生化被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。17.如权利要求16所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分通过化学接头被引入SEQIDNO:1的天然人J链序列中。18.如权利要求17所述的修饰的J链，其中所述化学接头是可裂解的或非可裂解的接头。19.如权利要求18所述的修饰的J链，其中所述可裂解的接头是化学上不稳定接头或酶不稳定接头。20.如权利要求18所述的修饰的J链，其中所述接头选自由以下组成的组：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物、活性酯、醛、双叠氮基化合物、双重氮衍生物、二异氰酸酯、以及双活性氟化合物。21.如权利要求16所述的修饰的J链，通过插入酶识别位点并且通过将外来结合部分经由肽或非肽接头翻译后连接于所述酶识别位点来修饰。22.如权利要求1至21中任一项所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分选自由以下组成的组：抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物缀合物、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、可溶性和膜结合蛋白、配体、受体、病毒样颗粒、蛋白毒素、酶、以及替代支架。23.如权利要求22所述的修饰的J链，其中所述替代支架选自由以下组成的组：darpin、纤连蛋白结构域、adnectin及knottin。24.如权利要求22所述的修饰的J链，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv及单结构域抗体。25.如权利要求24所述的修饰的J链，其中所述抗原结合片段是scFv。26.如权利要求1至21中任一项所述的修饰的J链，其中所述外来结合部分结合至效应细胞。27.如权利要求26所述的修饰的J链，其中所述效应细胞选自由以下组成的组：T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞及嗜中性粒细胞。28.如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：B基特，LG普莱斯塔，F张，R巴利加，
申请(专利权)人：IGM生命科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US