基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法和应用，该荧光探针的结构式为：，本发明专利技术提供了一种基于罗丹明衍生物的高选择性检测GSH的水溶性荧光探针。本发明专利技术以1,2,4‑偏苯三酸酐、3‑二乙氨基苯酚、水合肼与乙二醛为原料合成此荧光探针。一方面，用羧基修饰罗丹明结构，能大大提高探针的水溶性；另一方面，利用分析物的SH与探针的醛基之间发生水解‑加成反应，实现GSH与Cys及Hcy的区分。这是第一个基于罗丹明衍生物的能在100%水溶液中将GSH与Cys及Hcy高效区分的荧光探针。该探针对GSH表现出很高的灵敏度和很好的选择性，并能应用于细胞成像,检测细胞内的GSH。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光探针
，具体涉及基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法和应用。
技术介绍
近年来，由于荧光探针具有高灵敏度、高分辨率、对待测样品无损以及可实现原位、实时、快速检测等优点，已经被作为生物样品监测以及生物体内荧光成像的重要分析工具(Que,E.L.；Domaille,D.W.；Chang,C.J.Chem.Rev.2008,108,1517-1549)。大部分荧光探针被设计并用来检测金属阳离子，而几乎很少用来检测生物小分子(Chen,X.Q.；Pradhan,T.；Wang,F.；Kim,J.S.；Yoon,J.Y.Chem.Rev.,2012,112,1910–1956.)。谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及同型半胱氨酸(Hcy)统称为生物硫醇，他们在生命活动中发挥着重要的作用(Shang,L.；Qin,C.J.；Wang,T.；Wang,M.；Wang,L.X.；Dong,S.J.J.Phys.Chem.C.2007,111,13414-13417)。这些硫醇在生物体内的浓度的变化与某些生命过程正常与否息息相关(Hwang,C.；Sinskey,A.J.；Lodish,H.F.science1992,257,1496-1502)。谷胱甘肽广泛存在于生物体内，其在细胞内的含量为1.0-15mM(Meister,A.；Anderson,M.E.；Powrie,F.；Puri,R.N.Annu.Rev.Biochem.1983,52,711-760)。研究表明，GSH在细胞内发挥着非常重要的功能，包括维持细胞内氧化还原反应平衡、异型生物质的新陈代谢、细胞内信息传递以及基因表达(Kanzok,S.M.；Schirmer,R.H.；lozef,R.Becker,K.J.Biol.Chem.2000,275,40180-40186)。体内GSH水平不正常将会导致癌症、老化、心脏病以及其他的疾病(Whillier,S.；Raftos,J.E.；Kuchel,P.W.RedoxRep.2008,13,277-282)。正因为GSH有着非常重要的生理及临床意义，设计有效的荧光探针去精确检测细胞内谷胱甘肽的含量非常重要。由于对精确检测细胞内谷胱甘肽含量的需求越来越大，一些基于不同荧光团的荧光探针已经被合成，如香豆素类(Chen,C.Y.；Liu,W.；Xu,C.；Liu,W.S.Biosens.Bioelectron2015,71,68-74)、芘类(Hu,Y.；Heo,C.H.；Kim,G.；Jun,E.J.；Yin,J.；Kim,H.M.；Yoon,J.Anal.Chem.2015,87,3308-3313)、荧光素类(Wang,L.；Chen,H.Y.；Wang,H.L.；Wang,F.；Kambam,S.；Wang,Y.；ZhaoW.B.；Chen,X.Q.Sens.ActuatorsB2014,192,708-713)、氟硼吡咯类(Wang,F.Y.；Zhou,L.；Zhao,C.C.；Wang,R.；Fei,Q.；Luo,S.H.；Guo,Z.Q.；Tiana,H.；Zhu,W.H.Chem.Sci.2015,6,2584-2589)、花青素类(Niu,L.Y.；Guan,Y.X.；Chen,Y.Z.；Wu,L.Z.；Tung,C.H.；Q.Z.Yang,Chem.Soc.Rev.2015,44,6143-6160)、萘酰亚胺类(Beija,M.；Afonso,C.A.M.；Martinho,J.M.G.Chem.Soc.Rev.2009,38,2410-2433)、螺吡喃类(Shao,N.；Jin,J.Y.；Wang,H.；Zheng,J.；Yang,R.H.；Chan,W.H.；Abliz,Z.J.Am.Chem.Soc.2010,132,725-736)以及派洛宁类(Liu,H.；Wang,H.；Shenvi,S.；Hagen,T.M.；Liu,RRR.M.Acad.Sci.2004,1019,346-349)。尽管这些荧光探针对谷胱甘肽的检测有着重要的意义，但它们存在着以下四个缺点。(1)这些探针的分析波长短，因此容易被生物基质样品的自荧光信号干扰；(2)由于谷胱甘肽与其他生物硫醇即半胱氨酸及同型半胱氨酸具有非常相似的化学结构，因此有效的区分谷胱甘肽与半胱氨酸、同型半胱氨酸是非常困难的；(3)由于一些探针本身存在比较强的背景荧光或者检测分析物时荧光增强的倍数很小，导致该类荧光探针的灵敏度很低；(4)几乎所有这些被报道过的荧光探针仅溶于纯有机溶剂或有机-水组成的混合溶剂中，这都大大限制了荧光探针在生物体内的进一步的应用。荧光分子探针的主要应用于生物、医学和环境监测,所以在纯水溶液中的识别具有潜在的广泛应用价值。另外,许多探针分子的荧光性质会受质子的影响,在水溶液中可以通过缓冲溶液控制稳定的pH值,使识别研究的结果更可靠。因此，设计和合成具有长的分析波长、高的选择性和高的灵敏度并能在100％水溶液中高效的检测谷胱甘肽类荧光探针迫在眉睫。罗丹明衍生物是荧光探针领域中应用最广泛的一类染料，罗丹明类荧光探针具有分析波长长、摩尔吸光系数大、荧光量子产率高以及光稳定性较好等优点。最为关键的是，罗丹明的内酰胺螺环状结构没有荧光，破坏这种结构后能够引起荧光发射增强。由于此结构上的优势，罗丹明内酰胺类化合物是理想的OFF-ON型荧光分子探针，从而能实现对分析物高灵敏度的荧光检测。据我们所知，大部分罗丹明类荧光探针都用来监测金属阳离子(Li,D.；Li,C.Y.；Li,Y.F.；Qin,H.R.；Tan,K.Y.Sens.ActuatorsB2016,223,705-712)，报道过的文献很少有用来检测谷胱甘肽。本文利用罗丹明类荧光具有长的分析波长以及高的灵敏度的优点，设计并合成了一种简单的基于罗丹明的能在100％水溶液中检测谷胱甘肽的荧光探针。一方面，用羧基修饰罗丹明结构，能大大提高探针的水溶性；另一方面，利用分析物的SH与探针的醛基之间发生水解-加成反应，实现谷胱甘肽与半胱氨酸、同型半胱氨酸的区分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种基于罗丹明的GSH的水溶性荧光探针，该荧光探针具有长的分析波长、高灵敏度以及高选择性的检测GSH，并能够应用于活细胞的荧光成像。本专利技术的技术方案是，一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针，其结构式如下：本专利技术的荧光探针应用于GSH的检测，其特征在于探针本身处于闭环状态没有荧光，探针与GSH反应后螺环打开，从而导致荧光改变。所述的一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法。步骤如下：化合物Rh1的合成:在将1,2,4-偏苯三酸酐和3-二乙氨基苯酚加入到含有N,N-二甲基甲酰胺的圆底烧瓶中，在氮气保护下，磁力搅拌回流6小时，停止反应；反应混合物冷却至室温后，加入二次蒸馏水，充分搅拌后，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层并减压蒸馏除去溶剂。粗产品用二氯甲烷/甲醇为6:1(体积比)的洗脱剂柱层析分离得红色固体(化合物Rh1)。化合物Rh2的合成：将化合物Rh1溶解在无水甲醇中，搅拌下滴加水合肼。在氮气保护下，磁力搅拌回流反应混合物搅拌下回流24小时；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法和应用，其结构式如下：。

【技术特征摘要】
1.一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法和应用，其结构式如下：。2.根据权利要求1所述的一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探针的制备方法，其特征在于它的具体制备步骤为：1）在将1,2,4-偏苯三酸酐和3-二乙氨基苯酚加入到含有N,N-二甲基甲酰胺的圆底烧瓶中，在氮气保护下，磁力搅拌回流6小时，停止反应；反应混合物冷却至室温后，加入二次蒸馏水，充分搅拌后，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层并减压蒸馏除去溶剂；粗产品用二氯甲烷/甲醇为6:1（体积比）的洗脱剂柱层析分离得红色固体（化合物Rh1）；2）将化合物Rh1溶解在无水甲醇中，搅拌下滴加水合肼；在氮气保护下，磁力搅拌回流反应混合物搅拌下回流24小时；减压蒸馏除去溶剂；粗产品用二氯甲烷/甲醇为10:1（体积比）的洗脱剂柱层析分离得白色固体（化合物Rh2）；3）将化合物Rh2和乙二醛溶解在无水甲醇中搅拌；在室温下，磁力搅拌反应混合物12小时；减压蒸馏除去溶剂；粗产品用二氯甲烷/水为12:1（体积比）的洗脱剂柱层析分离得淡黄色固体，得目标产物。3.根据权利要求1所述的一种基于罗丹明的GSH水溶性荧光探...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春艳，欧阳娟，李勇飞，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43