一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法技术

技术编号:14701073 阅读:1326 留言:0更新日期:2017-02-24 17:50
本发明专利技术涉及一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法,包括:(1)外部形态;(2)微观结构;(3)化学试剂检测;(4)分子序列鉴定。本发明专利技术通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)进行鉴定,具有鉴定准确性高、定位准确的优点,在我国蘑菇(Agaricus sp.)品种的鉴定中具有代表性,具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蘑菇鉴定领域,特别涉及一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法。
技术介绍
我国蘑菇鉴定从20世纪初就已有,但一直较为原始,且鉴定不准确,很多情况下不能定位到种的水平。随着显微镜在蘑菇鉴定中的应用,微观结构观察已应用于蘑菇的鉴定中。但显微鉴定较为复杂且准确度不高。20世纪后期,分子序列逐渐在鉴定中有所应用,但也只能是作为参考。蘑菇属(Agaricus)中的种类多达上千种,而中国的蘑菇属(Agaricus)种类占世界的很大一部分。而中国蘑菇属(Agaricus)种类的鉴定一直没有快捷的方法,特别是对具有重大经济价值的蘑菇种类的鉴定,便于维护研究人员的权益,因此发现并鉴定从而进行蘑菇属(Agaricus)具有重要经济意义种类的鉴定利用势在必行。面对这种形势,需要研究快速鉴定蘑菇属(Agaricus)种类的技术研究和方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法,该方法通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇进行鉴定,具有鉴定准确性高、定位准确的优点,在我国蘑菇(Agaricussp.)品种的鉴定中具有代表性,具有良好的应用前景。本专利技术的一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法,包括:(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括:10-35cm大的菌盖,5-20cm粗的菌柄,由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶,位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长;(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开,静置,剖面由白色变为粉红色;(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5%KOH溶液,滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面,静置,KOH溶液滴定处变为浅黄色;(4)分子序列鉴定①DNA提取:提取总DNA,测定浓度后调节至100ng/μL备用;②PCR扩增:选用正向引物ITS5和ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段;反应体系:总量20μL,包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液(50mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2、100mmol/Ltris-HCl,pH9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng;PCR反应程序:94℃预变性4min,34个循环中94℃40s、52℃40s、72℃50s,最后72℃延伸8min;③PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序,测序结果经过比对拼接后确定最终序列;④ITS序列分析:将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对,通常序列相似度大于99%,即可判定为同一种;经上述步骤(1)~(4)的鉴定,确定为中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。所述步骤(2)中的静置时间为2~3分钟。所述步骤(3)中的静置时间为5~6分钟。所述步骤(4)中的提取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA,包括:1)将-20℃冷冻干燥的中国美味蘑菇子实体0.1g研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,65℃保温45min以上,间或轻摇混匀;2)12000rpm,4℃离心20min,取上清液;3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液,其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1,轻轻混匀10min,12000rpm,4℃离心10min,取上清液移入新离心管中;4)加入等体积的氯仿、异戊醇混合液,其中的氯仿、异戊醇的体积比为24:1,轻轻混匀10min,12000rpm,4℃离心10min,取上清液移入新离心管中;5)加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm,4℃离心10min,去上清;6)将沉淀依次用体积百分数为75%的乙醇、10mmol/L醋酸钾各洗涤2~3次,每次8000rpm,室温离心5min;7)加入预冷的体积百分数为95%的乙醇,轻轻上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;8)加入100uL10×TE缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解;9)加入1uL10mg/mLRNaseA37℃水浴1hr,去除RNA,即得DNA提取物。所述步骤(4)中的正向引物ITS5为:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’,反向引物ITS4为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。有益效果本专利技术通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇进行鉴定,具有鉴定准确性高、定位准确的优点,在我国蘑菇(Agaricussp.)品种的鉴定中具有代表性,具有良好的应用前景。附图说明图1为中国美味蘑菇子实体;图2为中国美味蘑菇剖开颜色变化;图3为中国美味蘑菇化学试剂鉴定颜色变化。具体实施方式下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。应理解,这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解,在阅读了本专利技术讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1取某地野生中国美味蘑菇:(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括:10-35cm大的菌盖,5-20cm粗的菌柄,由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶,位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长;(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开,静置2min,剖面由白色变为粉红色;(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5%KOH溶液,滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面,静置5min,KOH溶液滴定处变为浅黄色;(4)分子序列鉴定①DNA提取:提取总DNA,测定浓度后调节至100ng/μL备用;②PCR扩增:选用真菌正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段;反应体系:总量20μL,包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液(50mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2、100mmol/Ltris-HCl,pH9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng;PCR反应程序:94℃预变性5min,30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min,最后72℃延伸10min;③PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序,测序结果经过比对拼接后确定最终序列;④ITS序列分析:将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对,通常序列相似度大于99%,即可判定为同一种;提取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA,包括:1)将-20℃冷冻干燥的中国美味蘑菇子实体0.1g研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,65℃保温45min以上,间或轻摇混匀;2)本文档来自技高网...
一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201610874824.html" title="一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法原文来自X技术">中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法</a>

【技术保护点】
一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法,包括:(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括:10‑35cm大的菌盖,5‑20cm粗的菌柄,由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶,位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45‑55公分且周围有树木生长;(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开,静置,剖面由白色变为粉红色;(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5%KOH溶液,滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面,静置,KOH溶液滴定处变为浅黄色;(4)分子序列鉴定①DNA提取:提取总DNA,测定浓度后调节至100ng/μL备用;②PCR扩增:选用正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段;反应体系:总量20μL,包含有Taq酶5U、10mmol/L dNTP 2.5μL、10×PCR扩增缓冲液5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA 100ng;PCR反应程序:94℃预变性5min,30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min,最后72℃延伸10min;③PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序,测序结果经过比对拼接后确定最终序列;④ITS序列分析:将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对,通常序列相似度大于99%,即可判定为同一种;经上述步骤(1)~(4)的鉴定,确定为中国美味蘑菇。...

【技术特征摘要】
1.一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)的鉴定方法,包括:(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括:10-35cm大的菌盖,5-20cm粗的菌柄,由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶,位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长;(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开,静置,剖面由白色变为粉红色;(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5%KOH溶液,滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面,静置,KOH溶液滴定处变为浅黄色;(4)分子序列鉴定①DNA提取:提取总DNA,测定浓度后调节至100ng/μL备用;②PCR扩增:选用正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段;反应体系:总量20μL,包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng;PCR反应程序:94℃预变性5min,30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min,最后72℃延伸10min;③PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序,测序结果经过比对拼接后确定最终序列;④ITS序列分析:将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对,通常序列相似度大于99%,即可判定为同一种;经上述步骤(1)~(4)的鉴定,确定为中国美味蘑菇。2.根据权利要求1所述的一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)的鉴定方法,其特征在于:所述步骤(2)中的静置时间为2~3分钟。3.根据权利要求1所述的一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeli...

【专利技术属性】
技术研发人员:李传华曲明清李正鹏宋晓霞奚莉萍汪虹陈明杰李文张劲松鲍大鹏黄建春沈学香
申请(专利权)人:上海市农业科学院
类型:发明
国别省市:上海;31

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