本发明专利技术涉及一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法，包括：(1)外部形态；(2)微观结构；(3)化学试剂检测；(4)分子序列鉴定。本发明专利技术通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)进行鉴定，具有鉴定准确性高、定位准确的优点，在我国蘑菇(Agaricus sp.)品种的鉴定中具有代表性，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蘑菇鉴定领域，特别涉及一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法。
技术介绍
我国蘑菇鉴定从20世纪初就已有，但一直较为原始，且鉴定不准确，很多情况下不能定位到种的水平。随着显微镜在蘑菇鉴定中的应用，微观结构观察已应用于蘑菇的鉴定中。但显微鉴定较为复杂且准确度不高。20世纪后期，分子序列逐渐在鉴定中有所应用，但也只能是作为参考。蘑菇属(Agaricus)中的种类多达上千种，而中国的蘑菇属(Agaricus)种类占世界的很大一部分。而中国蘑菇属(Agaricus)种类的鉴定一直没有快捷的方法，特别是对具有重大经济价值的蘑菇种类的鉴定，便于维护研究人员的权益，因此发现并鉴定从而进行蘑菇属(Agaricus)具有重要经济意义种类的鉴定利用势在必行。面对这种形势，需要研究快速鉴定蘑菇属(Agaricus)种类的技术研究和方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法，该方法通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇进行鉴定，具有鉴定准确性高、定位准确的优点，在我国蘑菇(Agaricussp.)品种的鉴定中具有代表性，具有良好的应用前景。本专利技术的一种中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)的鉴定方法，包括：(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括：10-35cm大的菌盖，5-20cm粗的菌柄，由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长；(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开，静置，剖面由白色变为粉红色；(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面，静置，KOH溶液滴定处变为浅黄色；(4)分子序列鉴定①DNA提取：提取总DNA，测定浓度后调节至100ng/μL备用；②PCR扩增：选用正向引物ITS5和ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系：总量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液(50mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2、100mmol/Ltris-HCl，pH9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng；PCR反应程序：94℃预变性4min，34个循环中94℃40s、52℃40s、72℃50s，最后72℃延伸8min；③PCR测序：经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；④ITS序列分析：将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对，通常序列相似度大于99％，即可判定为同一种；经上述步骤(1)～(4)的鉴定，确定为中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。所述步骤(2)中的静置时间为2～3分钟。所述步骤(3)中的静置时间为5～6分钟。所述步骤(4)中的提取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA，包括：1)将-20℃冷冻干燥的中国美味蘑菇子实体0.1g研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；2)12000rpm，4℃离心20min，取上清液；3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；4)加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其中的氯仿、异戊醇的体积比为24：1，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；5)加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm，4℃离心10min，去上清；6)将沉淀依次用体积百分数为75％的乙醇、10mmol/L醋酸钾各洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；7)加入预冷的体积百分数为95％的乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；8)加入100uL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；9)加入1uL10mg/mLRNaseA37℃水浴1hr，去除RNA，即得DNA提取物。所述步骤(4)中的正向引物ITS5为：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，反向引物ITS4为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。有益效果本专利技术通过采用外部形态特征、解剖结构颜色变化、化学试剂和分子序列鉴定相结合的方法对中国美味蘑菇进行鉴定，具有鉴定准确性高、定位准确的优点，在我国蘑菇(Agaricussp.)品种的鉴定中具有代表性，具有良好的应用前景。附图说明图1为中国美味蘑菇子实体；图2为中国美味蘑菇剖开颜色变化；图3为中国美味蘑菇化学试剂鉴定颜色变化。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1取某地野生中国美味蘑菇：(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括：10-35cm大的菌盖，5-20cm粗的菌柄，由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长；(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开，静置2min，剖面由白色变为粉红色；(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面，静置5min，KOH溶液滴定处变为浅黄色；(4)分子序列鉴定①DNA提取：提取总DNA，测定浓度后调节至100ng/μL备用；②PCR扩增：选用真菌正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系：总量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液(50mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2、100mmol/Ltris-HCl，pH9)5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng；PCR反应程序：94℃预变性5min，30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min，最后72℃延伸10min；③PCR测序：经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；④ITS序列分析：将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对，通常序列相似度大于99％，即可判定为同一种；提取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA，包括：1)将-20℃冷冻干燥的中国美味蘑菇子实体0.1g研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；2)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)的鉴定方法，包括：(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括：10‑35cm大的菌盖，5‑20cm粗的菌柄，由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45‑55公分且周围有树木生长；(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开，静置，剖面由白色变为粉红色；(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面，静置，KOH溶液滴定处变为浅黄色；(4)分子序列鉴定①DNA提取：提取总DNA，测定浓度后调节至100ng/μL备用；②PCR扩增：选用正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系：总量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/L dNTP 2.5μL、10×PCR扩增缓冲液5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA 100ng；PCR反应程序：94℃预变性5min，30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min，最后72℃延伸10min；③PCR测序：经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；④ITS序列分析：将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对，通常序列相似度大于99％，即可判定为同一种；经上述步骤(1)～(4)的鉴定，确定为中国美味蘑菇。...
【技术特征摘要】
1.一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)的鉴定方法，包括：(1)外部形态鉴定中国美味蘑菇(A.sinodeliciosus)外部形态包括：10-35cm大的菌盖，5-20cm粗的菌柄，由粉红色、肉色变化成褐色至暗黑色的菌褶，位于菌柄上部的菌环以及整个子实体全部埋生于地下45-55公分且周围有树木生长；(2)解剖鉴定将中国美味蘑菇从菌盖和菌柄的中间剖开，静置，剖面由白色变为粉红色；(3)化学试剂鉴定取事先配制好的5％KOH溶液，滴于新鲜中国美味蘑菇子实体菌盖表面，静置，KOH溶液滴定处变为浅黄色；(4)分子序列鉴定①DNA提取：提取总DNA，测定浓度后调节至100ng/μL备用；②PCR扩增：选用正向引物ITS5和反向引物ITS4扩增中国美味蘑菇核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系：总量20μL，包含有Taq酶5U、10mmol/LdNTP2.5μL、10×PCR扩增缓冲液5μL、10μmol/L引物各2.5μL、模版DNA100ng；PCR反应程序：94℃预变性5min，30个循环中94℃50s、51℃50s、72℃1min，最后72℃延伸10min；③PCR测序：经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；④ITS序列分析：将测序好的序列利用NCBI中的Genebank中准确可靠的序列进行Blast比对，通常序列相似度大于99％，即可判定为同一种；经上述步骤(1)～(4)的鉴定，确定为中国美味蘑菇。2.根据权利要求1所述的一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)中的静置时间为2～3分钟。3.根据权利要求1所述的一种中国美味蘑菇(Agaricussinodeli...
【专利技术属性】
技术研发人员：李传华，曲明清，李正鹏，宋晓霞，奚莉萍，汪虹，陈明杰，李文，张劲松，鲍大鹏，黄建春，沈学香，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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