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检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒制造技术

技术编号:14684946 阅读:53 留言:0更新日期:2017-02-22 18:37
检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA)试剂盒,由包被有3A9单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12和显色底物3'.3'.5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)组成。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤:(1)制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板;(2)制备辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12:(3)配备显色底物3'.3'.5,5'‑四甲基联苯胺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于链球菌病免疫诊断、检测
,涉及一种链球菌即无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定及其试剂盒的制备方法。技术背景无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种具有高毒力的革兰氏阳性菌,能感染多种淡水和海水鱼类,每年给世界水产养殖业带来数以亿计的损失,近几年在我国南方罗非鱼养殖区肆虐流行,由于生产上缺乏有效的诊断检测方法,致使罗非鱼无乳链球菌病没有得到有效监控和防治,给罗非鱼养殖造成了造成重大损失,严重阻碍了我国罗非鱼养殖业的发展。目前对无乳链球菌病诊断检测方法主要有:(1)常规的形态培养鉴定、生理生化鉴定等传统方法,这些传统的诊断检测方法通常精确度较低,耗时耗力(2)分子生物学检测方法,主要有PCR、LAMP等一些分子生物学方法,这些分子生物学方法虽然灵敏度高,但操作技术难度高,基层使用有一定的困难。(3)免疫学检测方法,免疫学的检测方面很多,有检抗体的,也有检抗原的,检抗体的如间接酶联免疫吸附试验,这种方法只能检到循环抗体,但不能区分现症感染和既往感染,因此不能对疫病做出准确的诊断。本专利技术利用我们制备和筛选鉴定的抗鱼源无乳链球菌的特异的3A9和4C12单克隆抗体建立一种新的罗非鱼链球菌病免疫诊断检测方法,即:双抗体夹心ELISA法的检测方法,本专利技术由于利用了针对罗非鱼无乳链球菌的特异的单克隆抗体,不仅可以直接检测病原进行现症诊断,而且由于单克隆抗体可大量的制备、质量容易控制,因此可进一步提高检测方法的稳定性、灵敏度和特异性。本专利技术为临床上诊断和检测罗非鱼源无乳链球菌病提供了一种新的方法,可用于罗非鱼无乳链球菌的检测、诊断和药物治疗评价等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足,为临床提供一种检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法,可为临床实际提供一种用于罗非鱼无乳链球菌的检测、诊断和药物治疗评价的新方法。本专利技术所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,包被有3A9单克隆抗体的多孔板,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12和显色底物3'.3'.5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。本专利技术为达到上述目标,选择了专利申请人制备、筛选的3A9单克隆抗体作为包被抗体,所述单克隆抗体由保藏号为:CCTCCNO:C2014244的杂交瘤细胞生产,C2014244杂交瘤细胞保存在中国典型培养物保存中心。所述试剂盒中,包被有3A9单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12和显色底物3'.3'.5,5'-四甲基联苯胺分别各自单独存放。进一步的:所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体浓度为2.0-200.0μg/mL。进一步的:所述试剂盒还包括显色底物3'.3'.5,5'-四甲基联苯胺。进一步的:所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体的用量为100μL,浓度为10.0μg/mL。进一步的:所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体为4C12,所述辣根过氧化物酶标记单克隆抗体4C12的制备方法为:1)按常规方法制备小鼠腹水单克隆抗体4C12,用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯小鼠腹水单克隆抗体4C12,以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL,单克隆抗体4C12放置于-20℃环境下保存备用;2)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中;3)将步骤2)获得的溶液加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,冰浴下避光搅拌15分钟;4)将步骤3)获得的溶液装入透析袋中,用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;5)在步骤4)获得的溶液中加入20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mgIgG,冰浴避光搅拌2小时;6)将步骤5)获得的溶液加入0.1ml浓度为4mg/mlNaBH4液,混匀,再在4℃环境下放置2小时;7)将步骤6)获得的溶液装入透析袋中,用0.15MpH7.4PBS透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;8)将步骤7)获得的溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵,置于4℃环境下2小时;9)将步骤8)获得的溶液放入离心管内,用离心机3000rpm离心30min,弃去上清,沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次,最后沉淀物溶于0.15MpH7.4的PBS中;10)将步骤9)得到的溶液装入透析袋中,用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析,祛除铵离子后(用萘氏试剂检测),12000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,即酶标4C12,酶标4C12分装后冰冻保存,用间接ELISA方法检测,酶标4C12的效价达1:6400,最适稀释工作浓度为1:1600。进一步的:本专利技术还提供了检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒制备方法,所述步骤如下:A.制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板用碳酸盐缓冲液制成的包被液将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液,所述包被液由Na2CO31.59g、NaHCO32.93g,加双蒸水定容至1000mL制成,其在4℃条件下保存,然后将所述3A9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内,置于4℃环境下包被12-24小时,包被时间届满后,将质量浓度5%的脱脂奶粉溶液加入多孔板的各孔内,并在37℃进行封闭反应,封闭反应时间至少1-1.5小时,封闭反应结束后,用洗涤缓冲液洗涤多孔板,当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有3A9单克隆抗体的多孔板,其保存温度为4℃;B.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12按常规方法:用杂交瘤细胞制备小鼠腹水单克隆抗体4C12,用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯,以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL,单克隆抗体至-20℃保存备用;C.配备显色底物3'.3'.5,5'-四甲基联苯胺;D.制备检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,所述辣根过氧化物酶HRP标记4C12步骤如下:步骤1)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中;步骤2)在步骤1)获得的溶液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,冰浴下避光搅拌15分钟;步骤3)在步骤2)获得的溶液装入透析袋中,用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;步骤4)在步骤3)获得的溶液中加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化辣根过氧化物酶的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mgIgG(经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12和经ProteinG亲和层析纯化的4C12),冰浴避光搅拌2小时;步骤5)将步骤4)获得的溶液加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置4℃2小时;步骤6)将步骤5)获得的溶液装入透析袋中,用0.15MpH7.4PBS透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;步骤7)将步骤6)获得的溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵,置4℃2小时;步骤8)将步骤7)获得的溶液置于离心管内,用离心机在3000rpm条件下离心30min,弃去上清,沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次,最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中;步骤9)将步骤8获得的溶液装入透析本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由包被有3A9单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12。

【技术特征摘要】
1.一种检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由包被有3A9单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12。2.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体浓度为2.0-200.0μg/mL。3.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括显色底物3'.3'.5,5'-四甲基联苯胺。4.根据权利要求2所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体的用量为100μL,浓度为10.0μg/mL。5.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒,其特征在于:所述辣根过氧化物酶标记单克隆抗体4C12的制备方法的步骤为,1)按常规方法制备小鼠腹水单克隆抗体4C12,用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯小鼠腹水单克隆抗体4C12,以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL,单克隆抗体4C12放置于-20℃环境下保存备用;2)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中;3)将步骤2)获得的溶液加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,冰浴下避光搅拌15分钟;4)将步骤3)获得的溶液装入透析袋中,用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;5)在步骤4)获得的溶液中加入20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mgIgG,冰浴避光搅拌2小时;6)将步骤5)获得的溶液加入0.1ml浓度为4mg/mlNaBH4液,混匀,再在4℃环境下放置2小时;7)将步骤6)获得的溶液装入透析袋中,用0.15MpH7.4PBS透析,4小时换液一次,期间换液3-5次;8)将步骤7)获得的溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵,置于4℃环境下2小时;9)将步骤8)获得的溶液放入离心管内,用离心机3000rpm离心30min,弃去上清,沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次,最后沉淀物溶于0.15MpH7.4的PBS中;10)将步骤9)得到的溶液装入透析袋中,用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析,祛除铵离子后,12000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,即酶标4C12,酶标4C12分装后冰冻保存。6.一种检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法,其特征在于,其制备步骤如下:(1)制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板用碳酸盐缓冲液制成的包被液将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液,所述包被液由Na2CO31.59g、NaHCO32.93g,加双蒸水定容至1000mL制成,其在4℃条件下保存,然后将所述3A9单克隆抗体稀释液加...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈汉忠梁万文李旻王凯陈明吴文德王瑞
申请(专利权)人:广西大学广西壮族自治区水产科学研究院
类型:发明
国别省市:广西;45

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