一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，涉及DNA的提取方法，属生物技术领域。具体为选择琴叶风吹楠硅胶干燥树皮材料及在QIAGENPlant Mini Kit试剂盒的Buffer AP1提取液中加入1％的PVP，水浴时间延长至20min进行琴叶风吹楠DNA提取。本发明专利技术通过选择硅胶干燥树皮为材料，解决野外采集琴叶风吹楠新鲜叶片困难、且用新鲜叶片和落叶提取的DNA得率低、质量差的难题；用QIAGEN试剂盒改良法替代了传统的CTAB提取DNA的方法，解决了琴叶风吹楠用CTAB法和QIAGEN试剂盒原来的方法提取不到满足于实验要求的DNA难题，通过在QIAGEN试剂盒Buffer AP1中加入1％的PVP作为多酚络合剂和抗氧化剂，使琴叶风吹楠中的多酚不被分离到提取液，延长水浴时间使细胞尽可能多的破壁，细胞内大部分核酸渗出。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，特别是适用于琴叶风吹楠DNA提取的方法。属生物

技术介绍
DNA的提取是满足分子生物学实验的最重要、最基本的操作，提取高质量的DNA对于分子生物学实验非常重要。目前，提取DNA的材料为植物各部分组织，但多用幼嫩组织(嫩叶、嫩茎等)，而对于一些高大树种，采集嫩叶相当困难；提取方法有CTAB法、SDS法、高盐低pH法以及试剂盒法等，不同物种根据实际情况(内含物、组织结构差异等)，在以上几种方法的基础上进行了改良，以便提取得到高质量的DNA[1-8]。琴叶风吹楠(Horsfieldiapandurifolia)科属：肉豆蔻科风吹楠属，倒卵状长圆形至提琴形，长16一34厘米，宽6－9.5厘米，先端短渐尖至突尖，基部楔形至宽楔形，两面无毛，侧脉9一22对；叶柄粗壮，长2.2一3厘米。花单性，雌雄同株，圆锥花序腋生，分枝稀疏，长12一15(一30)厘米，花序轴紫红色；花小，直径约2毫米，花被裂片通常个雄蕊10，合生成球形。果序圆锥状，长10一18厘米，通常着果1一3；果卵状椭圆形，基部下延成柄，长3－4.5厘米，外面光滑，成熟时2瓣裂，假种皮鲜红色，先端微撕裂状；种子1，顶端具突尖，种皮硬壳质。产地：云南。通常为生长在热带雨林沟谷的上层树种，成年树株高可达20-30m，采集新鲜叶片非常困难。至今，很少有琴叶风吹楠，甚至肉豆蔻科的关于分子生物学研究的报道，特别是提取琴叶风吹楠植物DNA方面更是没见报道，deWilde[9]和吴裕[10]等人分别用分子证据发表了关于风吹楠属、琴叶风吹楠分类学问题的文章，但文中也没有提到关于肉豆蔻科及琴叶风吹楠DNA提取的方法。参考文献：[1]普晓兰，李鹏，杜凡，等.巨龙竹基因组DNA的提取及RAPD反应条件的优化[J]，昆明理工大学学报(理工版)，2003，28(1)：127-131.[2]黄建安，黄意欢.茶树基因组DNA的高效提取方法[J]，湖南农业大学学报，2003,29(5)：402-404.[3]蒋细旺，包满珠，李智崎，等.菊花DNA提纯方法的优化[J]，江汉大学学报，2002,19(3)：42-44.[4]冉策，陈柳，陆家兰，等.三种DNA提取方法对检测草莓镶脉病毒稳定性的研究[J].华北农学报，2015，30(3)：200-204.[5]宋艳波，吴国良，牛洪斌.改良CTAB法在核桃叶片基因组DNA提取中的应用研究[J]，山西农业大学学报(自然科学版)，2011，31(2)：109-112.[6]陈林杨，宋敏舒，查红光，等.一种改良的植物基因组DNA通用提取方法[J]，植物分类与资源学报，2014,36(3)：375-380.[7]张晓祥，王玲，寿路路.一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法[J].中国农学通报，2012，28(36)：46-49.[8]赵红霞，谢攀，黄志坚，等.一种改良的水稻总DNA提取方法[J]，湖北大学学报(自然科学版)，2006，28(4)：389-392.[9]deWildeWJ.Endocomia,anewgenusofMyristicaceae[J].Blumea,1984，30：173-196.[10]吴裕，毛常丽，张凤良，等.琴叶风吹楠(肉豆蔻科)分类学位置再研究[J]，植物研究，2015，35(5)：652-659.
技术实现思路
本专利技术目的在于为了克服以上困难，本专利技术提供了一种适用于琴叶风吹楠采样及DNA的提取方法，其目的在于解决琴叶风吹楠采样困难，CTAB法、QIAGEN试剂盒法提取不到满足于分子实验所需的DNA等问题。本专利技术提供一种适用于琴叶风吹楠DNA提取的方法，包括选择的样品为琴叶风吹楠树皮，提取的方法为QIAGEN试剂盒改良法，即在QIAGEN试剂盒BufferAP1提取液中加入1％的PVP(以下简称1％PVP-AP1提取液)，在试剂盒提取步骤中的水浴时间由10min延长至20min。所述的树皮样品为嫩枝树皮，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥；所述的1％PVP-AP1提取液配方为：在100mlBufferAP1提取液中加入1gPVP；所述的水浴时间为液氮研磨后加入1％PVP-AP1提取液后，65℃水浴20min；在以上所述中，优选的，如果能采到嫩枝，则要嫩树皮；本专利技术野外采样时，带上变色硅胶用于干燥样品。采样时能采到嫩枝则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥。干燥好的样品用于后续DNA的提取。本专利技术琴叶风吹楠DNA提取的方法具体步骤如下：1)准备1％PVP-AP1提取液；2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl1％PVP-AP1提取液和4μlRNaseA，涡旋后65℃水浴20min，中间颠倒混匀2-3次；3)水浴结束后加入130μlBufferP3，混匀后，冰浴5min；4)14000rpm，离心5min；5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；6)将收集管中的液体转入一新的离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；7)转移6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，离心1min，(如果6中样品还有剩余，可重复此步骤)8)将收集柱转入一新的2ml收集管，加入500μlAW2，大于8000rpm，离心1min，弃收集管中的液体；9)加入500μlAW2，大于12000rpm，离心2min；10)将吸附柱放入一新的1.5ml离心管；11)加入100μlBufferAE，室温放置5min-10min，大于8000rpm，离心1min；12)将吸附柱重新放入一新的1.5ml离心管，重复步骤11。本专利技术还提供1％PVP-AP1提取液的配制方法，为：在100mlBufferAP1提取液中加入1gPVP。本专利技术通过选择硅胶干燥树皮为材料，解决野外采集琴叶风吹楠新鲜叶片困难、且用新鲜叶片和落叶提取的DNA得率低、质量差的难题；用QIAGEN试剂盒改良法替代了传统的CTAB提取DNA的方法，解决了琴叶风吹楠用CTAB法和QIAGEN试剂盒原来的方法提取不到满足于实验要求的DNA难题，通过在QIAGEN试剂盒BufferAP1中加入1％的PVP作为多酚络合剂和抗氧化剂，使琴叶风吹楠中的多酚不被分离到提取液，延长水浴时间使细胞尽可能多的破壁，细胞内大部分核酸渗出。通过材料选择和提取方法改良可以提高所得DNA的质量。本专利技术有益效果：可操作的采样方式简便、快速和高质量提取琴叶风吹楠DNA的方法，对于需要进行琴叶风吹楠分子生物学研究的研究者而言，显得非常重要。附图说明图1为本专利技术实施例1、实施例2和实施例3提取琴叶风吹楠叶片、树皮的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。图2为实施例4的电泳图谱。图3为实施例4的峰图。图4为实施例4的原始数据。图5为实施例4的0/1数据。具体实施方法以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术将琴叶风吹楠的叶片材料换为琴叶风吹楠的树皮材料进行DNA提取，提取方法为QIAGEN试剂盒改良法，即在AP1中加入1％PVP(以下称1％PVP-AP1)，水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，选取的样品为硅胶干燥树皮，选择的提取方法是QIAGEN试剂盒改良法(在QIAGEN试剂盒Buffer AP1提取液中加入1％的PVP，水浴时间延长至20min)进行琴叶风吹楠DNA的提取。

【技术特征摘要】
1.一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，选取的样品为硅胶干燥树皮，选择的提取方法是QIAGEN试剂盒改良法(在QIAGEN试剂盒BufferAP1提取液中加入1％的PVP，水浴时间延长至20min)进行琴叶风吹楠DNA的提取。2.根据权利要求1所述的提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：野外采样时，带上变色硅胶用于干燥样品。采样时能采到嫩枝则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥。干燥好的样品用于后续DNA的提取。3.根据权利要求1或2所述的提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)准备1％PVP-AP1提取液；2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl1％PVP-AP1提取液和4μlRNaseA，涡旋后65℃水浴20min，中间颠倒混匀2-3次；3)水浴结束后加入130μlBufferP3，混匀后，冰浴5min；4)14000rpm，离心5min；5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；6)将收集管中的液体转入一新的离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；7)转移6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛常丽，张凤良，李小琴，杨湉，杨晓玲，胡永华，吴裕，张辉，
申请(专利权)人：云南省热带作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53