一种用于去除组织细胞的试剂盒和去细胞方法技术

本发明专利技术涉及一种用于去除组织细胞的试剂盒，其由A液、B液和C液组成，其中所述A液为亲水性去细胞溶液，为CHAPS为浓度5‑50g/L并且TnBP浓度为1‑5mM的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液；所述B液为CHAPS浓度为5‑50g/L、TnBP浓度为1‑5mM、ASB‑14浓度为5‑50g/L并且SB 3‑10浓度为5‑50g/L的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液；并且所述C液为全能核酸酶溶液；还涉及一种用于去除组织细胞的去细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织。以上试剂和方法制备的异种组织去细胞生物支架去细胞完全，细胞外基质成分保留好，力学性能损伤小，免疫原性低，体内组织相容性好且不易钙化，制备周期短、费用低，优于以往异种组织去细胞生物支架，具有很好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程材料领域，更特别地，涉及一种用于去除组织细胞的试剂盒以及去细胞方法。
技术介绍
去细胞生物支架被广泛用于组织工程与再生医学中，目前应用于临床和临床前期研究的组织工程瓣膜支架材料亦主要为去细胞生物支架。然而免疫原性是阻碍异种去细胞生物支架应用于临床的最大障碍。CryoLife公司在临床上推出了两种去细胞瓣膜(SynerGraft)：CryoValve(同种异体去细胞主动脉瓣膜)和500/700(异种猪去细胞瓣膜)。CryoValve去细胞瓣膜自2000年已应用于超过5700例患者，近期临床结果较为满意。而同种异体主动脉瓣膜的最大不足是由于供体短缺而造成来源稀少。因此来源于猪或牛的异种组织因其来源广泛且与人体组织成分和性能相似，常用于去细胞瓣膜的构建。然而，异种猪瓣制备的500/700去细胞瓣膜用于4例患儿的右室流出道重建术，3例患儿均在术后一年内死亡，死因与强烈的免疫排斥反应导致瓣膜衰败相关。随后，异种组织来源的去细胞瓣膜在临床上的应用已寥寥无几。由此可见，异种组织的免疫原性是阻碍异种组织去细胞生物支架进一步应用于临床的关键难题。异种组织的免疫原性主要来源于细胞，因此去细胞可降低异种组织的免疫原性。目前去细胞基质的制备方法主要包括物理方法如压力法、冻融法，化学试剂如去污剂、有机溶剂，生物制剂如酶类等。多种去细胞方法均可完全地去除组织中的细胞成分，然而在这些方法处理的去细胞生物支架中仍可检测到异种抗原如α-Gal、MHCI，这些抗原的存在最终导致去细胞生物支架植入体内后发生免疫排斥反应和迅速衰败。单纯地去除组织的细胞成分难以最大限度地降低其免疫原性，这提醒我们需另辟蹊径。此外，目前应用的去细胞试剂和去细胞方法对瓣膜的结构和力学性能均造成不同程度的破坏，这些损伤可能会导致去细胞瓣膜植入体内后发生功能不全或迅速衰败。因此，需要一种新的去细胞生物支架的制备方法和试剂，其不仅能去除异种组织的免疫原性，而且能最大限度地保留细胞外基质成分与力学性能。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种一种用于去除组织细胞的试剂盒，其由A液、B液和C液组成，其中所述A液为亲水性去细胞溶液，为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonate,CHAPS)为浓度5-50g/L并且磷酸三丁酯(tri(n-butyl)phosphate,TnBP)浓度为1-5mM的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；所述B液为CHAPS浓度为5-50g/L、TnBP浓度为1-5mM、脒基磺基甜菜碱(amidosulfobetaine14,ASB-14)浓度为5-50g/L并且硫代甜菜碱10(sulfobetaine3-10,SB3-10)浓度为5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；并且所述C液为全能核酸酶溶液。优选地，在所述A液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述A液的pH值为7.8。优选地，在所述B液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述ASB-14的浓度为10g/L，所述SB3-10的浓度为20g/L,所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述B液的pH值为7.8。优选地，所述全能核酸酶溶液的溶剂为pH值为8.0的50mMTris-HCl缓冲液，并且所述全能核酸酶的浓度为100unit/ml。优选地，所述全能核酸酶溶液中还包含1mM的MgCl2。本专利技术还提供了一种用于去除组织细胞的去细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织，包括用所述A液、B液和C液依次浸泡所述组织的步骤。进一步地，所述方法包括以下步骤：S1：用所述A液处理所述组织；S2：用无菌水漂洗经S1处理的所述组织；S3：用所述B液处理经S2处理的所述组织；S4：用PBS漂洗经S3处理的所述组织；S5：用所述C液处理经S4处理的所述组织；S6：用PBS漂洗经S5处理的所述组织，即得到去细胞的生物支架。优选地，所述方法包括以下步骤：S1：将所述组织浸没于所述A液中，于室温下持续振荡24小时；S2：用无菌水漂洗经S1处理的组织6次，每次10分钟；S3：将经S2处理的组织浸没于所述B液中，于室温下持续振荡24小时；S4：用PBS漂洗经S3处理的组织4次，每次6小时；S5：将经S4处理的组织浸没于所述C液中，于37℃下持续振荡24小时；S6：用PBS漂洗经S5处理的组织4次，每次6小时，即得到去细胞的生物支架。优选地，所述组织为猪主动脉瓣膜。本专利技术还提供了一种去细胞生物支架，其通过上述方法得到。通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。(1)异种抗原主要是蛋白质，本专利技术利用蛋白溶解的原理，以连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法制备得到本专利技术的异种组织去细胞生物支架。其中，亲水性去细胞溶液中包含CHAPS和TnBP，被用来溶解和去除异种组织中的水溶性抗原；而亲脂性去细胞溶液除CHAPS和TnBP提供水溶性蛋白的溶解外，SB3-10和ASB-14被用来去除异种组织中的脂溶性蛋白。全能核酸酶，能降解所有形式(包括单链、双链、线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性，在广泛条件范围具有很高的特异性。(2)本专利技术采用连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除猪主动脉瓣膜的细胞成分，较好地保留了猪主动脉瓣膜结构和细胞外基质成分(胶原纤维、弹性纤维、糖胺聚糖)，对力学性能影响小，组织结构及力学性能接近正常组织。(3)本专利技术采用连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除猪主动脉瓣膜中的异种抗原α-Gal和MHCI，其处理的瓣膜在体外能降低白细胞的激活。表明该方法可降低机体对去细胞瓣膜的免疫反应。此外，基于蛋白溶解的去细胞方法能够不仅去除α-Gal，还能去除一些未知的非α-Gal异种抗原，从而改善去细胞生物支架的生物相容性。(4)本专利技术获得的去细胞生物支架具有良好的生物相容性，植入大鼠体内后发生了组织重塑，表现为植入物大量降解，原组织结构不明显，较为规则的结缔组织形成，组织中央可见肌细胞，且不易发生钙化。(5)本专利技术的异种组织去细胞生物支架制备周期短、费用低，并可制备成不同规格，优于以往异种去细胞基质，具有很好的临床应用前景。附图说明图1为天然瓣膜和去细胞瓣膜DAPI染色的显微照片；图2为是天然瓣膜和去细胞瓣膜组织学染色(HE、Masson、VVG染色)的显微照片(F:Fibrosa纤维层；S:Spongiosa疏松层；V:Ventricularis心室层，箭头指示弹性纤维)；图3为天然瓣膜和去细胞瓣膜的扫描电镜照片；图4为天然瓣膜和去细胞瓣膜的含水量统计图；图5为天然瓣膜和去细胞瓣膜的胶原蛋白含量统计图；图6为天然瓣膜和去细胞瓣膜的弹性蛋白含量统计图；图7为天然瓣膜和去细胞瓣膜的糖胺聚糖含量统计图；图8为去细胞瓣膜的大体形态以及力学性能检测时周向和径向样本制备示意图；图9为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限拉伸应变；图10为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限抗张强度；图11为天然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于去除组织细胞的试剂盒，其特征在于，由A液、B液和C液组成，其中所述A液为亲水性去细胞溶液，为CHAPS为浓度5‑50g/L并且TnBP浓度为1‑5mM的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液；所述B液为CHAPS浓度为5‑50g/L、TnBP浓度为1‑5mM、ASB‑14浓度为5‑50g/L并且SB 3‑10浓度为5‑50g/L的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液；并且所述C液为全能核酸酶溶液。

【技术特征摘要】
1.一种用于去除组织细胞的试剂盒，其特征在于，由A液、B液和C液组成，其中所述A液为亲水性去细胞溶液，为CHAPS为浓度5-50g/L并且TnBP浓度为1-5mM的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；所述B液为CHAPS浓度为5-50g/L、TnBP浓度为1-5mM、ASB-14浓度为5-50g/L并且SB3-10浓度为5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；并且所述C液为全能核酸酶溶液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述A液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述A液的pH值为7.8。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述B液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述ASB-14的浓度为10g/L，所述SB3-10的浓度为20g/L,所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述B液的pH值为7.8。4.如权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述全能核酸酶溶液的溶剂为pH值为8.0的50mMTris-HCl缓冲液，并且所述全能核酸酶的浓度为100unit/ml。5.如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述全能核酸酶溶液中还包含1mM的...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔韡华，董念国，史嘉玮，陈思，李庚，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42