大菱鲆SmLTL重组蛋白及其制备与应用方法技术

一种大菱鲆SmLTL的重组蛋白及其制备与应用方法，属于分子生物学和基因工程领域，它是由118个氨基酸组成，分子量为13.47KDa，等电点为8.52，其氨基酸序列SEQ NO:1。本发明专利技术制备了大菱鲆SmLTL重组蛋白，且大菱鲆SmLTL重组蛋白能够抑制纤毛虫活力，并与虫体具有结合现象，为大菱鲆抗纤毛虫药物的研发发挥积极、重要的推动作用。

Turbot SmLTL recombinant protein and preparation and application method thereof

The preparation method and application of a recombinant protein of turbot SmLTL and its preparation, and belongs to the field of molecular biology and gene engineering, which is composed of 118 amino acids. The molecular weight of 13.47KDa and isoelectric point is 8.52, the amino acid sequence of SEQ NO:1. Turbot SmLTL recombinant protein prepared in the invention and turbot SmLTL recombinant protein could inhibit the activity of ciliates, and has combined with the phenomenon and the body, for the development of anti drug turbot ciliates play an active and important role in promoting.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，具体地涉及一种大菱鲆SmLTL重组蛋白及其制备与应用方法。
技术介绍
鱼类皮肤分泌的大量粘液广泛覆盖在鱼体表面构成与外界接触的第一道门户，在保护鱼体抵抗养殖环境变化以及抵御外界病原生物侵袭起着至关重要的作用。鱼类体表分泌物中存在多种生物活性因子，其中粘液凝集素(lectin)做为鱼类体表粘液中的重要天然免疫因子，逐渐被国内外学者关注。本专利技术做出之前，Lily-typelectin作为粘液凝集素中主要类型之一，最早是从红鳍东方鲀(Takifugurubripes)体表粘液中提取出的(pufflectin),是一种比较特殊的凝集素，其氨基酸序列与单子叶甘露糖凝集素(MMB)具有高度同源性；据报道，MMB是一种重要的植物保护因子，其转基因植株可以抵抗吸吮性害虫及线虫等的侵袭；目前对于Lily-typelectin研究仅局限于河豚T.rubripes,线鳢C.striata以及半滑舌鳎C.semilaevis，然而，对于Lily-typelectin在寄生虫抑制等应用方面研究鲜有报道，其抗虫性的免疫效应尚不清楚。综上所述，大菱鲆Lily-typelectin(SmLTL)重组蛋白制备及其对盾纤毛虫活力抑制研究，国内外尚未有报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种大菱鲆SmLTL重组蛋白的制备方法及该蛋白对盾纤毛虫活力抑制性应用。本专利技术是按照以下操作技术方案完成的：一种大菱鲆SmLTL的重组蛋白，它是由118个氨基酸组成，分子量为13.47KDa，等电点为8.52，其氨基酸序列如下：所述大菱鲆SmLTL的重组蛋白的制备方法，具体步骤如下：(1)对大菱鲆SmLTL(Genbankaccessionno.KU199003)进行基因序列的设计和优化，并人工合成核酸片段；(2)通过NdeI/HindIII限制性酶切位点将步骤(1)中合成的核酸片段亚克隆到表达载体pET43.1a上，构建重组表达质粒pET-SmLTL；(3)重组表达质粒pET-SmLTL热激法转化感受态细胞BL21(DE3)；(4)加入IPTG，15℃表达过夜，并放大培养；(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；(6)Western-blot方法检测重组表达蛋白。进一步，所述的步骤(1)人工合成的核酸片段为进一步，所述的放大培养：将菌种接种到含氨苄青霉素LB培养基中，于37℃*200rpm摇床中生长过夜；第二天接种到含100ug/mL氨苄青霉素的3LTB培养基中，放入37℃*200rpm摇床中生长至OD＝0.6-0.8时，将摇床温度降至15℃，1h后加入终浓度0.5mMIPTG诱导生长过夜；8000rpm*15min*4℃离心收集湿菌，并用磷酸缓冲盐重悬一次以清洗菌体。进一步，所述的超声裂解时用500W功率的超声波，在冰浴中进行超声，每超声3s，间歇8s，总计20min。本专利技术还提供一种用于抑制盾纤毛虫的组合物，包含上述大菱鲆SmLTL重组蛋白。本专利技术还提供大菱鲆SmLTL重组蛋白在抑制盾纤毛虫药物中的应用。本专利技术与现有技术相比的有益效果：第一，通过密码子优化的方法，克服了大肠杆菌的密码子偏爱的缺点，使得蛋白获得高表达；第二，本专利技术通过重组制备了大菱鲆SmLTL重组蛋白，且大菱鲆SmLTL重组蛋白能够抑制纤毛虫活力，并与虫体具有结合现象，为大菱鲆抗纤毛虫药物的研发发挥积极、重要的推动作用。附图说明图1为大菱鲆SmLTL重组蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE结果；其中LaneM:SDS-PAGEProteinmarker；Lane0:对照；Lane1:15℃诱导过夜；Lane2:37℃诱导4h。图2为SmLTL重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE结果；其中LaneM:SDS-PAGEProteinmarker；Lane1:全菌破菌离心后上清；Lane2:上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane3-6:50mM咪唑的BufferA洗脱液；Lane7-10:100mM咪唑的BufferA洗脱液；Lane11-22:300mM咪唑的BufferA洗脱液。图3为SmLTL重组蛋白的Western-blot分析结果；LaneM2:WesternBlotMarker；Lane1：重组蛋白特异条带。具体实施方式下面通过实施例和附图来对本专利技术的技术方案作进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例1、大菱鲆SmLTL的核酸序列优化1.大菱鲆SmLTL的核酸序列优化与合成采用德泰生物科技(南京)有限公司最新开发的密码子优化软件(MaxCodonTMOptimizationProgram(V13))，进行SmLTL(Genbankaccessionno.KU199003)基因序列的设计和优化，优化的核酸序列为：2.亚克隆至表达载体pET43.1a上，构建重组表达质粒pET-SmLTL通过NdeI/HindIII限制性酶切位点将步骤1优化后的核酸序列亚克隆到表达载体pET43.1a上，构建重组表达质粒pET-SmLTL；实施例二、SmLTL蛋白在大肠杆菌系统中的表达与纯化1.SmLTL蛋白表达与鉴定(1)表达载体的纯化：从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5分钟；将约100ng的表达载体质粒pET-SmLTLDNA直接加入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min；将离心管放置42℃水浴，热激90s；快速将离心管转移至冰水浴中3min；拿出后取200ul的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中；放入摇床(37℃*195rpm)中生长1h；吸取50ul-80ul悬液均匀涂布含有100ug/mL氨苄青霉素(Amp)LB平板中；将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置、37℃培养过夜。(2)菌株的诱导表达：从转化平板中接种单克隆，加入3支4ml含100ug/mLAmp的LB培养基中，编号为标记为“0”“1”“2”；37℃*200rpm培养至OD600为0.5-0.8(通常需要2－3小时)；生长过程中无菌条件下取出样品测定OD600值；向试管培养液中加入终浓度0.5mMIPTG(“0”对照组不加IPTG)，通常“0”“1”放置15℃诱导过夜，“2”放置37℃诱导4h。(3)SDS-PAGE鉴定诱导表达结果：分别取“本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大菱鲆SmLTL的重组蛋白，其特征在于它是由118个氨基酸组成，分子量为13.47KDa，等电点为8.52，其氨基酸序列SEQ NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种大菱鲆SmLTL的重组蛋白，其特征在于它是由118个氨基酸组成，分
子量为13.47KDa，等电点为8.52，其氨基酸序列SEQNO:1。
2.权利要求1所述大菱鲆SmLTL的重组蛋白的制备方法，其特征在于它的具
体步骤如下：
(1)对大菱鲆SmLTL基因序列进行设计和优化，并人工合成核酸片段，所
述的大菱鲆SmLTL基因序列获得方式为Genbankaccessionno.KU199003；
(2)通过NdeI/HindIII限制性酶切位点将步骤(1)中合成的核酸片段亚
克隆到表达载体pET43.1a上，构建重组表达质粒pET-SmLTL；
(3)重组表达质粒pET-SmLTL热激法转化感受态细胞BL21(DE3)；
(4)加入IPTG，15℃表达过夜，并放大培养；
(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；
(6)Western-blot方法检测重组表达蛋白。
3.权利要求2所述的大菱鲆SmLTL的重组蛋白的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马爱军，黄智慧，孙志宾，夏丹丹，王新安，王婷，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37