循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途制造技术

提供一些方法用于制备突变的基因组区域的选择子，并用于采用选择子集合来分析在无细胞核酸样品中的基因变异。所述方法可用于测量受试者血液样品中来源于肿瘤的核酸，并因此用于监控受试者疾病的进展，所述方法也可用于癌症筛查、癌症诊断、癌症预测和癌症疗法设计。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】政府支持声明本专利技术是国防部授予的资助号为W81XWH-12-1-0285的政府资助项目。政府对该发明享有某些权利。专利技术背景肿瘤不断地将DNA流入到循环中，在那里可以轻易地获得(Strounetal.(1987)EurJCancerClinOncol23:707-712)。分析此类源于癌症的无细胞DNA(cfDNA)具有使检测和监控癌症发生革命性变化的潜力。对实体瘤而言，非侵害性的获取恶性DNA尤其具有吸引力，实体瘤不能不用侵害性的方法进行反复取样。对非小细胞肺癌(NSCLC)而言，之前使用基于PCR的测试检测血浆DNA中的基因复发点，例如KRAS或EGFR的突变(Taniguchietal.(2011)Clin.CancerRes.17:7808-7815；Gautschietal.(2007)CancerLett.254:265-273；Kuangetal.(2009)Clin.CancerRes.15:2630-2636；Roselletal.(2009)N.Engl.J.Med.361:958-967)，但是绝大多数患者缺乏这些基因的突变。其他研究建议通过全基因组测序(WGS)接着再进行cfDNA断点qPCR，鉴别特定患者肿瘤中的染色体重排(Learyetal.(2010)Sci.Transl.Med.2:20ra14；McBrideetal.(2010)GenesChrom.Cancer49:1062-1069)。尽管灵敏，此类方法需要优化每位患者的分子测试，限制了其广泛地应用于临床。最近，有几个团队报道了用基于扩增子的深度测序方法可检测最多6个反复突变基因的cfDNA突变(Forshewetal.(2012)Sci.Transl.Med.4:136ra168；Narayanetal.(2012)CancerRes.72:3492-3498；Kindeetal.(2011)Proc.NatlAcad.Sci.USA108:9530-9535)。虽然很有效，但是这些方法受限于可测的突变的数量(Rachlinetal.(2005)BMCGenomics6:102)和不能检测基因组融合体。PCT国际专利申请公布No.2011/103236描述了用“配对”库在癌症患者中鉴别个体化肿瘤标志物的方法。这些方法受限于监控体细胞染色体重排，然而，必须对每位患者进行个体化测试，因此，限制了其应用并且增加了其成本。美国专利申请公布No.2010/0041048A1描述了用“辐射(BEAMing)”技术(Beads,Emulsion,Amplification,andMagnetics)对结直肠癌患者进行肿瘤特异性无细胞DNA的定量。尽管该技术具有高灵敏度和特异性，但是该方法是针对单一突变，因此仅可将任一特定的测试应用于患者子集和/或需要针对特定患者进行优化。美国专利申请公布No.2012/0183967A1描述了鉴别和对基因变异进行定量的另外方法，包括用“辐射”技术分析DNA群体中的次要变体。美国专利申请公布No.2012/0214678A1描述了检测胎儿核酸及确定在母体样品中循环的无细胞胎儿核酸分数的方法和组合物。虽然灵敏，这些方法对出现在母体和胎儿核酸之间的多态性进行分析，而不是对产生于肿瘤细胞中的体细胞突变的多态性进行分析。另外，这些检测母体血液循环中的胎儿核酸的方法比检测癌症患者血液循环中肿瘤核酸的方法需要少得多的灵敏度，因为胎儿核酸的量比肿瘤核酸的量要多得多。美国专利申请公布Nos.2012/0237928A1及2013/0034546描述了测定包含核酸混合物的受试样品中的有关序列的拷贝数变化的方法。虽然极可能应用于癌症的分析，这些方法涉及测定核酸中重大结构变化例如易位、缺失和扩增，而不是单一的核苷酸变化。美国专利申请公布No.2012/0264121A1描述了估测基因组分数，例如胎儿分数，多态性如小基数变化或插入物缺失的方法。然而，这些方法不使用已优化的多态性文库，例如，包含反复突变的基因组区域的库。美国专利申请公布No.2013/0024127A1描述了用计算机计算混合样品中主要来源和次要来源中无细胞核酸百分比贡献的方法。然而，这些方法在鉴别或将已优化的多态性文库用于分析上不具有任何优势。PCT国际公布号WO2010/141955A2描述了通过分析从患者那里获得的样品的基因嵌板及确定该嵌板中的基因突变状态来检测癌症的方法。这些方法依靠相对小数量的已知癌症基因，然而，它们并不根据检测相关突变的有效性提供任何基因排序。另外，这些方法不能检测大多数实际癌症患者血浆样品中突变的存在。因此，有对新的并且改进的检测及监控癌症患者中肿瘤相关核酸方法的需求。专利技术概述本专利技术提供了用于循环肿瘤DNA(ctDNA)例如，存在于个体血液中的、来源于肿瘤细胞DNA序列的高灵敏度分析的组合物和方法，包括生物信息学分析方法。本专利技术的这些方法可称作深度测序的癌症个体化概况分析(CAPP-Seq)。特别相关的肿瘤有实体瘤，包括但不限于癌、肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、黑素瘤等，尽管不排除血液癌，例如白血病。本专利技术的方法将优化的库制备方法与多相生物信息学方法相结合，以设计DNA低聚核苷酸“选择子”群体，这些低聚核苷酸相应于目标癌症的反复突变区域。DNA低聚核苷酸选择子群体，它可称为选择子集合，包含用于多个基因组区域的探针，并且设计使得在多个基因组区域中的至少一种突变存在于大部分具有特定癌症的受试者中，并且在优选的实施方案中，大部分具有特定癌症的受试者中存在多个突变。在本专利技术的某些实施方案中，提供了用于鉴别适合于具体肿瘤类型的选择子集合的方法。还提供了选择子集合的低聚核苷酸组合物，这些组合物可以依附于固体底物提供，标记用于亲和性筛选等；及包含此类选择子集合的试剂盒。包括但不限于，适用于非小细胞肺癌(NSCLC)分析的选择子集合。此类试剂盒可包含用于CAPP-Seq数据生物信息学分析的可执行指令。在其他实施方案中，本专利技术提供了在诊断和监控个体患者癌症中使用选择子集合的方法。在此类实施方案中，选择子集合用于富集相应于最可能含有肿瘤特异性体细胞突变的基因组区域的ctDNA，例如通过杂交筛选。然后将“所筛选的”ctDNA扩增并测序，以确定在具体肿瘤中那些所筛选的基因组区域发生突变。最初将个体的种系DNA序列和/或个体肿瘤活检样品任选进行比较。这些体细胞突变提供了区别ctDNA和种系DNA的方法，因此提供了关于个体中肿瘤细胞的存在和数量的有用信息。在某些实施方案中，在一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在有需要的受试者中检测、诊断、预测癌症或选择癌症疗法的方法，所述方法包括：(a)获得源自于受试者的无细胞DNA(cfDNA)样品的序列信息；及(b)用来自于(a)的序列信息检测所述样品中的循环肿瘤DNA (ctDNA)，其中所述方法能够检测的ctDNA的百分比小于或等于总cfDNA的2%。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/7989251.一种在有需要的受试者中检测、诊断、预测癌症或选择癌症疗法的方法，所述方法包
括：
(a)获得源自于受试者的无细胞DNA(cfDNA)样品的序列信息；及
(b)用来自于(a)的序列信息检测所述样品中的循环肿瘤DNA(ctDNA)，其中所述方法
能够检测的ctDNA的百分比小于或等于总cfDNA的2%。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法能够检测的ctDNA的百分比小于或等于总
cfDNA的1.75%、1.5%、1.25%、1%、0.75%、0.50%、0.25%、0.1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、
0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、
0.003%、0.002%、0.001%、0.0005%或0.00001%。
3.权利要求1所述的方法，其中所述样品是血浆、血清、汗、呼吸、眼泪、唾液、尿、大便、
羊水或脑脊液样品。
4.权利要求1所述的方法，其中所述样品不是帕氏涂片、囊肿液或胰液样品。
5.权利要求1所述的方法，其中所述序列信息包含与至少2、3、5、8、10、20、30、40、100、
200、或300个基因组区域相关的信息。
6.权利要求5所述的方法，其中所述基因组区域包含外显子区域、内含子区域和未翻译
区域中的两个或更多个。
7.权利要求5所述的方法，其中所述基因组区域包含小于1.5兆碱基(Mb)、1Mb、500
kb、350kb、100kb、75kb、50kb或25kb的基因组。
8.权利要求1所述的方法，其中所述序列信息包含属于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、
25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个基因组区域的信息，所述基因组区域来自含多个
基因组区域的选择子集合。
9.权利要求8所述的方法，其中所述多个基因组区域基于包含基因组区域的选择子集
合，所述基因组区域包含存在于癌症受试者群体的一个或多个受试者中的一个或多个突
变。
10.权利要求8所述的方法，其中至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、
55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的所述多个基因组区域基于包含基因组区域的
选择子集合，所述基因组区域包含存在于癌症受试者群体的一个或多个受试者中的一个或
多个突变。
11.权利要求9或10所述的方法，其中所述选择子集合包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、
20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个选自表2和-18中任何一个的基因组区域。
12.权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤（a）的序列信息包括进行大规模的平行
测序。
13.权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤（a）的序列信息包括使用一个或多个衔
接子。
14.权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个衔接子包括含随机序列的分子条形
码。
15.权利要求1所述的方法，其中使用步骤(b)的序列信息包括检测受试者基因组的所
选区域中的SNVs、插入/缺失、拷贝数变体和重排中的一个或多个。
16.权利要求1所述的方法，其中使用步骤(b)的序列信息包括检测受试者基因组的所
选区域中的SNVs、插入/缺失、拷贝数变体和重排中的两个或更多个。
17.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)的检测不涉及进行数字PCR(dPCR)。
18.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)的检测包括将运算法则应用于所述序列
信息以确定选择子集合的一个或多个基因组区域的量。
19.权利要求1所述的方法，进一步包括基于ctDNA的检测，检测、诊断、预测受试者中的
癌症或选择癌症的疗法。
20.权利要求19所述的方法，其中诊断或预测癌症的灵敏度为至少约50%、52%、55%、
57%、60%、62%、65%、67%、70%、72%、75%、77%、80%、82%、85%、87%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、或99%。
21.权利要求19所述的方法，其中诊断或预测癌症的特异性为至少约50%、52%、55%、
57%、60%、62%、65%、67%、70%、72%、75%、77%、80%、82%、85%、87%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%或99%。
22.制备用于癌症的选择子集合的方法，所述方法包括：
(a)识别患癌症受试者群体中的一个或多个受试者中的包含突变的基因组区域；
(b)基于复发指数(RI)排列所述基因组区域的顺序，其中所述基因组区域的RI通过将
在该基因组区域中有突变的受试者或肿瘤的数除以所述基因组区域的大小确定；及
(c)基于所述RI制备选择子集合。
23.权利要求22所述的方法，其中所述基因组区域的至少一个子集是外显子区域、内含
子区域、未翻译区域或其组合。
24.权利要求22所述的方法，其中基于RI制备选择子集合包括选择复发指数在百分位
数前第70、第75、第80、第85、第90、或第95或更大的基因组区域。
25.权利要求22所述的方法，其中制备选择子集合包括将运算法则应用于排序的基因
组区域的子集。
26.权利要求22所述的方法，其中制备选择子集合包括选择使所述选择子集合的突变
中位数/受试者最大化的基因组区域。
27.权利要求22所述的方法，其中制备选择子集合包括选择使所述选择子集合的受试
者数最大化的基因组区域。
28.权利要求22所述的方法，其中制备选择子集合包括选择使所述基因组区域的总大
小最小化的基因组区域。
29.一种计算机可读媒介物，包含两个或更多个基因组区域的序列信息，其中：
(a)所述两个或更多个基因组区域包含一个或多个突变，所述突变存在于患第一类型
癌症的第一受试者群体中大于或等于80%肿瘤中；
(b)所述两个或更多个基因组区域表示小于1.5Mb的基因组；及
(c)下述中的一个或多个：
(i)所述病症不是毛细胞白血病、卵巢癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；
(ii)基因组区域包含在至少一个受癌症折磨的受试者中的至少一种突变；
(iii)所述两个或更多个基因组区域包含一个或多个突变，所述突变存在于患第二类
型癌症的第二受试者群体中；
(iv)所述两个或更多个基因组区域源自于两个或更多个不同的基因；
(v)所述基因组区域包含两个或更多个突变；或
(vi)所述两个或更多个基因组区域包含至少10kb。
30.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述基因组区域包含一个或多个突变，
所述突变存在于患第二类型癌症的第二受试者群体中大于或等于60%肿瘤中。
31.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述基因组区域源自于2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多
个不同的基因。
32.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述基因组区域包含至少1、5、10、15、
20、25、30、35、40、45、或50kb。
33.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述序列信息包含属于所述两个或更
多个基因组区域的基因组坐标。
34.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述序列信息包含属于所述两个或更
多个基因组区域的核酸序列。
35.权利要求29所述的计算机可读媒介物，其中所述序列信息包含所述两个或更多个
基因组区域的长度。
36.一种包含一组低聚核苷酸的组合物，所述低聚核苷酸选择性地与多个基因组区域
杂交，其中：
(a)大于或等于80%的来自于癌症受试者群体的肿瘤包括在所述基因组区域中的一种
或多种突变；
(b)所述多个基因组区域表示小于1.5Mb的基因组；及
(c)所述低聚核苷酸组包含选择性地与多个基因组DNA区域杂交的5个或更多个不同
的低聚核苷酸。
37.权利要求36所述的组合物，其中所述基因组DNA区域包含至少2个在表2和...

【专利技术属性】
技术研发人员：M迪恩，AA阿利扎德，AM纽曼，SV布拉特曼，
申请(专利权)人：莱兰斯坦福初级大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国;US