本发明专利技术公开了从植物提取液中选择性提取分离石蒜碱的表面分子印迹纳米微球的制备及其应用。可将该纳米微球作为填充料制成固相萃取柱从植物提取液中提取分离、纯化石蒜碱。本发明专利技术固相萃取柱具有高选择性、高柱容量，达6.68μmol/g。对目标物质回收率好(92％‑105％)，制备成本低，材料易得，功能化过程简单，适应性强，易于批量生产的特点，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米微球制备、官能团化及其在中药活性成分分离中应用的
，涉及一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球的制备及利用该纳米材料为固相萃取剂分离、纯化天然产物中的石蒜碱。
技术介绍
石蒜碱是传统药用植物石蒜科(Amaryllidaceae)中的生物碱成分。生物活性研究表明，石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗疟疾、抑制乙酰胆碱酯酶、保护心血管以及诱导肿瘤细胞凋亡等多种作用。[参见(a)A.Jimenez，A.Santos，G.AlonsoandD.Vazquez.Biochim.Biophys.Acta(BBA)：NucleicAcidsProteinSynth.1976，425，342-348.(b)Y.Toriizuka，E.Kinoshita，N.Kogure，M.Kitajima，A.Ishiyama，K.Otoguro，H.Yamada，S.OmuraandH.Takayama.Bioorgan.Med.Chem.2008，16，10182-10189.(c)J.Liu，Y.Yang，Y.Xu，C.Ma，C.QinandL.Zhang.Virol.J.2011，8，483-491.]植物提取液、各种中药复方及生物样品成分十分复杂。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，对中草药活性成分分离提取是至关重要的。目前对中草药样品前处理技术的研究也比较多，主要集中在固相萃取、液相萃取、超临界流体萃取、超滤离心和微波萃取等。其中固相萃取技术由于操作简单、快速、使用有机溶剂少、成本低、对环境的二次污染少等优点，已经成为目前中草药中活性成分提取和富集的主要技术手段。固相萃取的性能通常与其填料的特性紧密相关。硅胶柱、C18键合相柱、Al2O3柱发展较早，其普适性较强，对大多数化合物有比较好的富集，应用比较广泛。但最大缺点是选择性差，富集容量低[参见：王洪允，江骥，胡蓓，等.固相萃取技术进展及在生物药物分析中的应用[J].药物分析杂志，2003，23(3)，236]。分子印迹材料是为模板分子量身定做的高分子聚合物或者纳米材料，由于其经洗脱模板分子后，能留下在形状、大小以及识别位点都与模板分子相匹配的空穴，该空穴能重新识别模板分子，由于其兼有高效、稳定和特异选择性且制备价格低廉的特点，因而具有较广泛应用前景。然而目前广泛使用的分子印迹材料为整体印迹聚合物，具有包括低吸附能力低、不能完全成为模板以及不易洗脱等明显的缺陷。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种以石蒜碱为模板的表面分子印迹纳米微球为新型吸附分离材料，并以此作为固相萃取柱的固定相从中药粗提物中定向分离、富集、纯化石蒜碱的方法，由此可以获得高提取率的目标成分。本专利技术通过以下的技术方案实现的。采用的技术方案：一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱，所述的固相萃取柱的基质为石蒜碱表面分子印迹纳米微球，石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的SiO2纳米微球表面进行聚合反应制得，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。1.石蒜碱表面分子印迹纳米微球的制备：(1)SiO2纳米微球的制备：乙醇、氨水按照1∶2～2∶1的比例在圆底烧瓶中混合均匀，总体积控制在50～200mL，然后正硅酸四乙酯(TEOS)5～15mL、乙醇60～120mL迅速加入上述溶液中。混合后的溶液在室温下继续反应2～5h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的SiO2纳米微球；(2)SiO2纳米微球的乙烯基化：将按照上述方案制得的SiO2纳米微球0.3～1.5g添加到40～150mL甲苯溶液中分散混合，然后在溶液中加入3-(甲基丙烯酰氧基)丙基-三甲氧基硅烷(KH-570)2～8mL，混合后的溶液在氮气保护下80～95℃下反应8～15h，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的乙烯基化的SiO2纳米微球；(3)以石蒜碱为模板的表面分子印迹纳米微球的制备：石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的SiO2纳米微球表面进行聚合反应制得，具体步骤如下：20～40mg的石蒜碱、30～60mg的丙烯酰胺及500～1000mg乙二醇二甲基丙烯酸酯溶解于40～100mL的乙腈中，然后乙烯基化的SiO2纳米微球50～120mg也添加入上述溶液中超声分散，加入5～20mg的偶氮二异丁腈，通氮气20～60min。最后，在恒温振荡下，进行两步聚合反应。第一步在40～50℃反应6～7h，完毕后进行第二步聚合反应，第二步在50～60℃反应20～24h。反应获得的产品离心，同时用大量的乙醇洗涤多次去除表面未反应的化学试剂，在分子印迹纳米微球中残存的模板分子用甲醇/冰醋酸(比例为6∶1～1∶1)洗去，最后制得的表面分子印迹微球用大量的甲醇洗去，40～60℃真空干燥，获得石蒜碱表面分子印迹纳米微球。2.石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱制备：(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的石蒜碱表面分子印迹纳米微球干法填装入柱内；(3)在填装的石蒜碱表面分子印迹纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.6～1.2cm，制备得到固相萃取柱。3.固相萃取分离纯化植物提取液中的石蒜碱：在进行固相萃取之前，首先用(5～20)mL甲醇、乙睛或者相应的缓冲溶液活化表面分子印迹纳米微球，然后在真空泵负压驱动下使植物提取液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液乙腈/甲醇等把分析物洗脱收集到容器中，然后进行定性、定量分析。与现有的固相萃取柱相比，本专利技术所提供的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱具有以下优点：(1)选择性好，柱容量高，达到6.68μmol/g。(2)环境友好：本专利技术的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱本身是环境友好的，并且在萃取过程中，只需消耗极少量的有机溶剂，不会引入其他有毒有害物质；(3)在完成专利技术的过程中，选择文殊兰中石蒜碱作为研究目标物，对所述固相萃取柱的各项性能指标进行了反复测试。结果表明对于上述生物碱的加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程筛单，2mL的甲醇就可将上述物质洗脱下来。附图说明图1为石蒜碱表面分子印迹纳米微球合成示意图及应用于固相萃取植物提取液中石蒜碱示意图；图2为石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱示意图，图中为：固相萃取柱管1、上筛板2、下筛板3、石蒜碱表面分子印迹纳米微球填料4；图3为合成得到的原始SiO2纳米微球及石蒜碱表面分子印迹纳米微球透射电镜图(TEM)。具体实施方式以下通过实施例形式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。下面结合附图，通过具体实施例对本专利技术进一步详述。实施例1：石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取填料的制备实验材料：丙烯酰胺，批号为：A1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基质为石蒜碱表面分子印迹纳米微球，石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的二氧化硅纳米微球表面进行聚合反应制得，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。
【技术特征摘要】
1.一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基质为石蒜碱表面分子印迹纳米微球，石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的二氧化硅纳米微球表面进行聚合反应制得，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。2.如权利要求1所述的一种功能化石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱，其特征在于制备方法为：(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的石蒜碱表面分子印迹纳米微球干法填装入柱内；(3)在填装的石蒜碱表面分子印迹纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.6～1.2cm，制备得到固相萃取柱。3.一种制备石蒜碱表面分子印迹纳米微球的方法，其特征在于由原始二氧化硅纳米微球经乙烯基化、表面聚合所制得，按以下步骤进行：(1)二氧化硅纳米微球乙烯基化：SiO2纳米微球0.3～1.5g添加到40～150mL甲苯溶液中混合，然后在溶液中加入3-(甲基丙烯酰氧基)-丙基-三甲氧基硅...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱栋，杨瑞翔，文红梅，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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