本发明专利技术属于生化分离技术领域，具体涉及一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素及其应用。本发明专利技术采用生化分离纯化技术，结合分子生物学技术，首次证明表皮细胞抑裂素中对表皮细胞有丝分裂有抑制作用的主要活性成分为四连接素(Tetranectin,TN)，所述猪四连接素由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5.75，TN为从猪皮制备的皮抑素G1的主要活性物质，可以制备成治疗银屑病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化分离
，具体涉及一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素及其应用。
技术介绍
皮抑素G1具有明显的抑制表皮细胞有丝分裂的活性，因此可以作为缓解银屑病症状的药物，但半个多世纪来皮抑素G1既未用于治疗银屑病，亦未得到纯化，因此人们对其主要活性成分的化学性质知之甚少。目前有关皮抑素G1的研究除专利技术专利ZL201410036118.X外,未见其他报。
技术实现思路
：本专利技术需要解决的问题是探索皮抑素G1的主要活性成分，了解其化学结构和性质及其在制备治疗银屑病药物中的应用。本专利技术从猪皮经部分纯化得到的皮抑素G1开始，进一步纯化，通过阳离子交换凝胶层析，制备性SDS-PAGE,分离后将活性成分抽提物送质谱鉴定，发现在各蛋白成分中含量最高的成份为猪四连接素，和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)。通过DNA重组技术，在大肠杆菌中成功表达了四连接素(TN)和PEBP两种蛋白，并证实了TN具有很高的抑制活性，TN的单体活性更高，而PEBP虽然也有肯定的活性；但与TN比较则活性较低；显示皮抑素G1中主要的具有抑制活性的成分为TN。本专利技术所述猪四连接素由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5.75，其氨基酸序列为：本专利技术以皮抑素G1为起始材料，通过阳离子交换凝胶SP-sepharosFF柱层析，层析柱用pH6.80.02mol/L,PBS平衡后，将皮抑素G1调节pH至6.8上柱分离，最早出现一个极大的穿过峰，改变洗脱缓冲液PBS的pH值为8.0，出现一个很小的尖峰，称为洗脱峰1，再在此碱性缓冲液中加入0.5mNaCl，又得到洗脱峰2，层析图见图1.将三部分蛋白，分别对水透析、脱盐、冻干，加入pH6.8的0.02mol/LPBS溶解，测定活性.1、皮抑素G1活性测定方法(1)采用待试样品对人表皮永生细胞株(HaCat)细胞生长的抑制百分率表示活性。HaCat细胞由上海复祥生物技术有限公司提供。(2)测定方法：将HaCat细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在5％CO2培养箱中37℃培养至对数生长期，用0.25％胰酶从培养瓶壁上消化10分钟左右，振动培养瓶，收集细胞，离心洗去酶液，用培养液配成3×104/ml细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔加160μL细胞悬液，在CO2培养箱中培养24小时后，加入待测样品40μL，待测样品的配制：样品除菌后测定蛋白浓度，用培养液配成2.5μg/ml浓度(100ng/40μL)并作17次倍比稀释，每种浓度在每孔中加入40μL，共三个平行孔，对照组加40μL培养液，设6个平行孔，96孔板四周36个孔，因误差较大，一般只加200μLHank’s液,不参与实验，加样后96孔板在CO2培养箱中继续培养72小时，每孔中加入20μL5mg/ml的MTT，继续培养4小时后，倾去上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，溶液显蓝紫色，在酶标仪OD492nm处读数，以3个平行样品孔的平均OD值与6个对照孔的平均OD值，计算抑制百分比。(3)活性单位，中值(ED50值)及比活性的计算：活性单位：以蛋白质倍比稀释的次数为横坐标，以抑制百分率为纵坐标作图可得一S型曲线，画出上下平台，取上下平台的中值(ED50)查出中值时的抑制百分数，每抑制1％规定为1个毫单位(1mU),从中值处的蛋白含量可计算出该蛋白的比活性(U/mg)比活性＝活性单位(U)/mg蛋白从倍比稀释数换算成为蛋白量：如果中值时的稀释次数为6.95。起始蛋白浓度为100ng/孔。中值为6.95的蛋白量为2-6.95×100ng＝0.8088ng如中值ED50为27.7mU则比活性为27.7mU/0.8088ng＝34248.2U/mg(4)活性测定结果，发现仅洗脱峰1表现高活性，穿过峰无活性，洗脱峰2的比活性极低。峰1的活性测定结果见图2.(5)将洗脱峰1进行制备性SDS-PAGE分离，按考玛斯蓝染色显示有四群蛋白，见图3，将四群相应位置的蛋白胶条切下，置于玻璃瓶中，用平头玻璃棒尽量压碎，用0.02mol/L的pH6.8PBS4℃浸提过夜，次日吸出上清液，重复此过程三次，合并四次抽提液，透析，冻干，溶解，测蛋白，测活性，结果显示仅分子量2万左右的第3蛋白群表现高活性，见图4.(6)将带3蛋白再次进行SDS-PAGE,并在前沿溴酚蓝色带出胶后再继续电泳一小时，凝胶染色后带3出现分子量很接近的二条蛋白，将此二块凝胶送苏州普泰公司进行质谱分析，结果发现第一条带含7种成分，第二条带含6种成分，分析结果见下表。表1.质谱分析3号蛋白群中带1和带2中各成分的性质(带1含7个成分)编号含量％分子量MW性质110.496262.41猪未知蛋白21.641522.89猪未知蛋白343.922575.29猪四连接素4034388.22猪未知蛋白51.363287.39猪G-6-Pisomerarc637.921072.67猪磷脂酰乙醇胺结合蛋白74.915086.84猪血红蛋白亚基α(带2含6个成分)编号含量％分子量MW性质176.722575.29猪四连接素21.7122636.09猪未知蛋白33.118966.95猪磷酸丙酮酸水合酶414.816212.48猪血红蛋白亚基β53.715086.84猪血红蛋白亚基α60.196262.41猪未知蛋白其中含量最高的为猪四连接素(TN),其次为磷脂酰乙醇胺(PEBP)结合蛋白，其余含量较低的蛋白有的是参与新陈代谢中已知的酶和血红蛋白亚基，还有几种猪未知蛋白，显然其中TN和PEBP是皮抑素G1的主要活性成分。2为了辨明皮抑素G1的活性成分是TN还是PEBP，或者二者都没有活性，而是含量极低的猪未知蛋白，为此委托南京德泰公司进行TN和PEBP的DNA重组，并在大肠杆菌中成功表达，南京德泰生物技术公司对二种蛋白通过DNA重组技术分别在大肠杆菌中成功表达了四连接素TN和PEBP(分离方法相同)。工程细菌在含50μg/ml卡那霉素的LB试管中摇床(37℃，15rpm)中生长过夜，次日接种到含50μg/ml卡那霉素的1LTB培养基中在摇床中生长至OD600nm＝0.6-0.8时，将温度降至15℃，1小时后加入终浓度0.5mol/L,IPTG诱导生长16小时，离心收集细菌,分离纯化步骤如下。(1)菌泥破碎和初步纯化用BufferA:50mMNaCl,2mMDTT,1％TritonX-100,1μg/mlpepstatinA,1μg/mlLeupeptinpH8.0裂解菌泥。(2)超声裂解超声3s间歇8s，总计20min,离心13000rpm，20分钟，4℃离心取沉淀，重复此步骤2次。(3)用BufferB:50mMTris，150mMNaCl,2mMDTT,2mMEDTA,1％TritonX-100,pH8.0洗涤包涵体，离心取沉淀，重复两次。(4)用BufferC:50mMTris，150mMNaCl,2mMDTT,2mMEDTA,2M尿素,pH8.0洗涤包涵体，离心取沉淀。(5)用BufferD:50mMTris，150mMNaCl,10mMDTT,6MGdmCl,pH8.0洗涤包涵体，离心取上清。(6)分子筛层析纯化SuperdexTM200(p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素，其特征是由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5.75，其氨基酸序列为：
【技术特征摘要】
1.一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素，其特征是由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5...
【专利技术属性】
技术研发人员：金以丰，吴奇，张太平，马晓艳，宣佶，
申请(专利权)人：南京必优康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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