具有人源化FC‑γ受体的非人动物制造技术

本发明专利技术提供了经基因修饰的小鼠及用于制备和使用所述小鼠的方法和组合物，其中所述基因修饰包括FcγRI蛋白的人源化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关专利申请本申请要求2014年4月8日提交的临时申请No.61/977,037的优先权权益，该临时申请特此全文以引用方式并入本文。
技术介绍
Fc受体(FcR)是存在于免疫系统的细胞表面上并可在哺乳动物体内发挥免疫系统的多种功能的蛋白质。FcRs以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，诸如与附着于受感染细胞或入侵性病原体的抗体结合、通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)来刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞破坏微生物或受感染细胞。ADCC是免疫系统的效应子细胞裂解抗体所结合的靶细胞的过程。该过程依赖于预先暴露于外源抗原或细胞，从而产生抗体应答。可借助效应子细胞诸如自然杀伤(NK)细胞来介导ADCC，具体方式是使效应子细胞表面上表达的FcR与抗体的Fc部分结合，而抗体的Fc部分自身又与外源抗原或细胞结合。高亲和力FcγR1受体信号传导在免疫系统调节和效应子细胞功能方面起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术涵盖这样的认识：希望对非人动物诸如小鼠进行工程化改造，以表达人或杂合FcγRI蛋白，从而可以对人免疫效应子应答进行实验，这种实验是不能在人体内开展的。本专利技术还涵盖这样的认识：希望用人源化(人或杂合)FcγRI基因替换内源小鼠FcγRI基因。在一些实施例中，本专利技术提供了表达FcγRI蛋白的小鼠，该蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。在一些实施例中，人FcγRIα链的细胞外部分包含EC1结构域、EC2结构域、EC3结构域，或它们的组合。在一些实施例中，EC1结构域由与SEQ ID NO:3的外显子3具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。在一些实施例中，EC2结构域由与SEQ ID NO:3的外显子4具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。在一些实施例中，EC3结构域由与SEQ ID NO:3的外显子5具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。在一些实施例中，本专利技术提供了表达FcγRI蛋白的小鼠，该蛋白质包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分，其中该小鼠无法可检测地表达全长小鼠FcγRIα链。在一些实施例中，FcγRIα链的细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRIα链细胞质结构域。在一些实施例中，小鼠还表达包含整体或部分的小鼠FcγRIα链跨膜结构域的FcγRIα链。在一些实施例中，本专利技术提供了表达与SEQ ID NO:5具有至少70％、85％、90％或95％同一性的FcγRIα链氨基酸序列的小鼠。在一些实施例中，人或杂合FcγRI蛋白可检测地表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞和/或它们的组合上。在一些实施例中，施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)会升高人FcγRI蛋白水平。在一些实施例中，施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)不会升高单核细胞、中性粒细胞或树突细胞中的小鼠FcγRI蛋白水平。在一些实施例中，本专利技术提供了表达FcγRI基因的小鼠，该基因包含与小鼠FcγRI基因的一个或多个外显子有效连接的人FcγRI基因的一个或多个外显子。在一些实施例中，人FcγRI基因的外显子编码人FcγRI蛋白的一个或多个细胞外部分。在一些实施例中，小鼠FcγRI基因的外显子编码小鼠FcγRI蛋白的一个或多个细胞内部分。在一些实施例中，人FcγRI的外显子选自外显子3、4、5以及它们的组合。在一些实施例中，小鼠FcγRI的细胞内部分有效连接至一个或多个小鼠细胞内信号传导级联。在一些实施例中，本专利技术提供了表达人FcγRI的小鼠，其中小鼠的生殖系细胞缺少功能性小鼠FcγRI基因。在一些实施例中，本专利技术提供了表达人FcγRI的小鼠，其中小鼠的生殖系细胞缺少任何小鼠FcγRI基因。在一些实施例中，本专利技术提供了其基因组包含FcγRI基因的胚胎干细胞，该基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。在一些实施例中，FcγRI基因包含人FcγRI基因的外显子3、4和5。在一些实施例中，FcγRI基因还包含位于人外显子1旁侧的一个或多个人5’非翻译区。在一些实施例中，人FcγRI蛋白的细胞外部分包含EC1、EC2和EC3中的一者或多者。在一些实施例中，本专利技术提供了胚胎干细胞，其基因组包含与SEQ ID NO:5具有至少70％、85％、90％或95％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。在一些实施例中，胚胎干细胞包含的FcγRI基因具有小鼠FcγRI基因外显子6的氨基酸残基。在一些实施例中，小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRI蛋白细胞质结构域。在一些实施例中，本专利技术提供了包含人FcγRI基因的胚胎干细胞，其中人FcγRI基因位于内源FcγRI基因座处，该基因座如自然界中所存在的那样出现于小鼠基因组中。在一些实施例中，本专利技术提供了由本文所述的胚胎干细胞生成的小鼠胚胎。在一些实施例中，本专利技术提供了本文所述的小鼠胚胎干细胞用于制备转基因小鼠的用途。在一些实施例中，公开了制备表达FcγRI蛋白的小鼠的方法，该蛋白包含人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分，该方法包括以下步骤：(a)获取小鼠胚胎干细胞；(b)在胚胎细胞中用包含这样的核酸分子的基因组片段替换内源小鼠FcγRI基因，该核酸分子编码人FcγRI蛋白的具有人细胞外区域的部分；以及(c)使用(b)的胚胎细胞产生小鼠。在一些实施例中，本专利技术提供了基因组片段，其包含编码人FcγRI蛋白的具有人细胞外区域的部分的核酸分子，以及编码小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分的核酸分子。如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等义词使用。本申请中所用的任何由或不由约/大约修饰的数字，都意欲涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。本专利技术的其他特征、目的和优点在以下具体实施方式中是显而易见的。然而，应当理解，虽然具体实施方式指示了本专利技术的实施例，但仅以说明的方式给出，而并无限制性。对于本领域的技术人员而言，通过以下的具体实施方式，本专利技术范围内的各种变化和修改将变得显而易见。附图说明本文所包括的附图仅出于说明目的，而不具有限制性。图1示出了实验小鼠和野生型对照的FcγRI小鼠等位基因的基因分型。图2示出了实验小鼠和野生型对照的人FcγRI基因的相对拷贝数。图3示出了基于具有一个拷贝的人FcγRI的Het(+/-)小鼠、并采用平均ΔCt校准的基因拷贝数的变换数据。图4示出了从人类献血者获取的细胞中FcγRI受体的表达。图5示出了人FcγRI基因、小鼠FcγRI基因和人源化FcγRI基因的示意图(未按比例绘制)。图6示出了MAID 6074盒制备过程的示意图(未按比例绘制)。图7示出了具有人源化FcγRI基因的小鼠在脾和血液中表现出正常的细胞频率。图8示出了具有人源化FcγRI基因的小鼠体内的髓系脾细胞群。图9示出了巨噬细胞上鼠FcγRI表达的丧失，这些巨噬细胞来自具有人源化FcγRI基因的小鼠的脾。图10示出了单核细胞上人FcγRI表达的获得，这些单核细胞来自具有人源化FcγRI基因的小鼠的脾。图11示出了在巨噬细胞的FACS分析期间的设门策略，这些巨噬细胞从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达FcγRI蛋白的小鼠，所述FcγRI蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.08 US 61/977,0371.一种表达FcγRI蛋白的小鼠，所述FcγRI蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。2.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述人FcγRIα链细胞外部分包含EC1结构域、EC2结构域、EC3结构域，或它们的组合。3.根据权利要求2所述的小鼠，其中所述EC1结构域由与SEQ ID NO:3的外显子3具有至少90％同一性的外显子编码。4.根据权利要求2所述的小鼠，其中所述EC2结构域由与SEQ ID NO:3的外显子4具有至少90％同一性的外显子编码。5.根据权利要求2所述的小鼠，其中所述EC3结构域由与SEQ ID NO:3的外显子5具有至少90％同一性的外显子编码。6.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠不能可检测地表达全长小鼠FcγRIα链。7.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述FcγRIα链细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRIα链细胞质结构域。8.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白还包含整体或部分的小鼠FcγRIα链跨膜结构域。9.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。10.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或树突细胞上表达。11.根据权利要求10所述的小鼠，其中在向所述小鼠施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)后，所述FcγRI蛋白的所述表达升高。12.一种包含FcγRI基因的小鼠，所述FcγRI基因包含有效连接在一起的至少一个人FcγRI基因外显子和至少一个小鼠FcγRI基因外显子，所述人FcγRI基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分，所述小鼠FcγRI基因编码小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。13.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述人FcγRI基因的所述外显子选自外显子3、外显子4和外显子5。14.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述小鼠不表达功能性小鼠FcγRI基因。15.一种其基因组包含FcγRI基因的胚胎干细胞，所述FcγRI基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述FcγRI基因包含人FcγRI基因的外显子3、外显子4和外显子5。17.根据权利要求15所述的细胞，其中所述FcγRI基因还包含位于人外显子1旁侧的一个或多个人5′非翻译区。18.根据权利要求15所述的细胞，其中所述人FcγRI蛋白的所述细胞外部分包含EC1、EC2和EC3中的一者或多者。19.根据权利要求15所述的细胞，所述细胞包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。20.根据权利要求15所述的细胞，其中所述FcγRI基因包含小鼠FcγRI基因的外显子6。21.根据权利要求15所述的细胞，其中所述小鼠FcγRI蛋白的所述细胞内部分包含整体或部分的所述小鼠FcγRI蛋白细胞质...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·莫菲，L·麦克唐纳，C·古雷尔，K·A·梅格尔，N·图，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US