一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异结合sICAM‑1的核酸适体及试剂盒。本发明专利技术提供的核酸适体，与sICAM‑1具有较好的亲和能力。利用本发明专利技术的核酸适体，可以捕获溶液中的sICAM‑1，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明专利技术的试剂盒，具有高灵敏、成本低的特点，适合大规模的筛查。

Reagent kit for detecting eye disease and detection method thereof

The invention discloses a specific combination of sICAM 1 aptamer and kit. The present invention provides nucleic acid aptamer affinity, has good ability of sICAM and 1. The use of nucleic acid aptamer of the invention, can capture the sICAM in solution 1, the preparation of the corresponding kit will be used for eye disease screening. The kit of the invention has the advantages of high sensitivity and low cost, and is suitable for large-scale screening.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是内分泌科常见疾病之一，也是目前世界上治疗最为困难的疾病之一。TAO病程较长，各年龄段均可发生，以女性多发。轻者可影响生活、工作质量，损伤外貌，重者可导致视力下降，甚至失明，给患者带来了沉重的经济及心理负担。近年来，由于生活方式的改变，工作压力的增加，社会环境状况的变化，食用加碘盐的普及，以及不正规用药等因素，TAO的发病率明显上升，住院率高。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。近年来的研究表明，细胞间粘附分子-1的表达与自身免疫甲状腺病免疫病理过程密切相关。甲状腺炎患者的甲状腺组织内浸润淋巴细胞、内皮细胞的sICAM-1和sICAM-1表达异常活跃。另外，发现伴有突眼的患者血清sICAM-1水平异常增高，这是因为患者眼球后组织强烈表达sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多与眶周炎症浸润程度密切相关。此外，研究还发现，在药物的治疗过程中，甲状腺功能和临床症状的好转与血清sICAM-1水平的下降并不同步，往往甲状腺功能的恢复在很大程度上要早于sICAM-1的恢复。综上所述，可溶性细胞间粘附分子-1的浓度变化可能对于判断GD的自身免疫紊乱水平、停药与否和是否复发等具有重要意义。细胞间粘附分子-1的表达与甲状腺相关眼病有直接关联，因此，检测细胞间粘附分子-1的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测细胞间粘附分子-1的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异结合sICAM-1的核酸适体及其试剂盒。本专利技术提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。所述核酸适体与sICAM-1蛋白具有较好的亲和能力。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。所述核酸适体可用于制备检测sICAM-1的试剂盒。利用本专利技术的核酸适体，可以捕获血液中的sICAM-1，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本专利技术的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获sICAM-1进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本专利技术具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、核酸适体的筛选和制备设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：5’-ACGACTAACGTGTAACAG(N39)CAGTGCATGATGCTACGAA-3’；N39代表39个随机核苷酸。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug sICAM-1蛋白(通过陈志鸿等，人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定中公开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：sICAM-1-1：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:1)sICAM-1-2：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:2)sICAM-1-3：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:3)sICAM-1-4：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:4)sICAM-1-5：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:5)sICAM-1-6：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:6)sICAM-1-7：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于眼病检测的试剂盒，其特征在于：包含核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种用于眼病检测的试剂盒，其特征在于：包含核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID No：15所述。3. SEQ ID No：15所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，
申请(专利权)人：李倩，
类型：发明
国别省市：江苏;32