本发明专利技术公开一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的CCD。本发明专利技术还公开了一种带反馈的旋转全内反射显微方法。本发明专利技术通过对样品和显微物镜同步反馈控制，能够保证样品处于最佳照明面和最佳成像面，具有更好的照明均匀性和成像分辨率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及显微成像领域，特别涉及一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置。
技术介绍
随着生物科学研究的发展，特别是与膜相关的生物现象的研究，对于一种仅观察单层样品结构的显微方法有着强烈的需求。传统的显微方法中，照明时整个视场在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，为此光切片显微镜和全内反射显微镜(Tirf)都是提高z轴分辨率的技术手段。光切片显微镜，采用横向照明的方法，但由于衍射极限的存在横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。Tirf是一种利用全内反射原理，由于倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度可以实现不同的衰减系数，从而可以在细胞与装载波片之间形成200nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。但是由于激光散斑的存在会导致照明光场不均匀，为此一种旋转的全内反射显微方法能够克服这种缺点实现均匀的全反射光场照明，旋转全反射照明的显微方法中，照明角度决定了照明深度，但在调整过程中属于一种开环控制，一种根据成像情况，来判断照明角度，但这个过程对照明角度的控制精度不够，且不能实时调整。
技术实现思路
为了解决旋转全内反射显微方法中对于入射角度，以及实现样品与显微物镜之间的最佳距离自动调整，本专利技术提供了一种带反馈的旋转全反射显微方法及装置，通过反馈信号的控制有效的增加了系统对照明角度以及样品与显微物镜间的距离的自动的精度，为样品的层析照明、三维重构提供了技术上的保证。本专利技术所采用的具体技术方案如下：一种带反馈的旋转全内反射显微方法，包括以下步骤：1)二维振镜扫描系统可以改变激光光束的角度，与扫描透镜配合可在扫描透镜的前焦面上聚焦成一个位置可控的点；2)所述聚焦的激光光束经过准直透镜成为平行光，平行光被一“X”型分束镜分光，一路照射到二色镜上，一路经聚焦透镜聚焦到光强位置探测器上，形成光点一，所述“X型反射镜的透反比在90％以上”；3)所述照射到二色镜上的光被，聚焦到全反射物镜后焦面的光经过全反射显微物镜能够变成平行光照射到样品上，当照射到样品上的角度足够大时，会发生全反射，此时只有贴壁的薄层样品会被照明激发；4)在样品处发生全反射的激光再被显微物镜接收，在全反射物镜后焦面聚焦，再镜显微场景成为平行光，镜二色镜反射后再经过“X”型分束镜反射，反射光经聚焦透镜聚焦到光强位置探测器上，形成光点二；5)步骤2)中所述的光点一与步骤4)所述的光点二的位置信息反映了系统的全反射照明情况。计算机控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，通过控制显微物镜使光点一与光点二重合，以确定样品离显微物镜间的距离，通过两个重合光点的位置来确定全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度。6)样品发出的荧光被全反射物镜接收，然后经过显微场镜、透过二色镜、滤光片成像在CCD上。所述的二维扫描振镜系统在电压的控制下使激光在全内反射显微物镜的后焦面上的扫描轨迹为一个环形，环形的直径大小对应入射光的倾斜角度，CCD成像CCD的曝光时间等于振镜扫描周期的整数倍；本专利技术还提供了一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：照明模块：沿光路设置激光器、激光准直器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜，样品；反馈模块，包含“X”型分束镜，聚焦透镜，光强位置探测器，以及与二维扫描振镜、光强位置探测器、显微物镜z轴控制连接的计算机控制系统；荧光成像模块，包含滤光片、CCD以及与照明模块共用的样品、全反射显微物镜、显微场镜和二色镜。所述的照明模块，二维扫描振镜位于扫描透镜的后焦面上，扫描透镜与准直透镜构成4f系统，准直透镜与显微场镜构成4f系统，显微场镜与全反射显微物镜构成4f系统，样品位于全反射显微物镜的前焦面上，二色镜位于准直透镜和显微场镜之间；所述反馈模块，“X”型分束镜位于准直透镜跟二色镜之间，光强位置探测器位于聚焦透镜的前焦面上；所述荧光成像模块，样品位于全反射显微物镜的前焦面上，场镜跟全反射显微物镜构成4f系统，CCD位于场镜的后焦面上，二色镜，滤光片位于CCD跟场镜之间。本专利技术的工作原理如下：光在全反射时光强分布满足公式 E = A exp [ - k 1 z sin 2 θ 1 - n 2 ] exp [ i ( k 1 xsinθ 1 - ω t ) ] ]]>当入射角度θ1大于全反射角时，光强沿着z轴方向就有很强的衰减，衰减系数为因此能够实现薄样品照明，而且随着角度的改变衰减系数是不同的，因此可以通过改变角度实现z轴的差别照明，从而实现样品的3D还原。照明光束聚焦在全反射物镜的后焦面聚焦点离中心光轴的距离决定了照明角度的大小。在旋转全反射照明系统中，全反射面位于全反射显微物镜的前焦面上，因此，全反射光会沿着与入射光对称光路回射到显微物镜的后焦面上，显微物镜的后焦面与位置探测校准CCD处于共轭成像面上，全反射回去的光会聚焦在位置探测校准CCD成像面上，由于“X”型分束镜的作用，在“X”型分束镜正交放置时，从激光器照射过来的激光和全反射回来的光会重合成一个点。当旋转扫描时，聚焦点在CCD成像面上画成一个圈。假设全反射回来的激光形成的扫描环为环1，“X”型分束镜第一次反射形成的扫描环为环2，若环1的直径大于环2的直径，代表着样品向外离焦，若环1的直径小于环2的直径，代表样品向内离焦；环2直径的大小代表了全反射角度的大小。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：(1)自反馈全内反射系统，能够根据照明位置探测CCD探测到的光斑位置，自动调整全反射角；(2)用位置探测CCD探测光斑位置，能够比常规全反射显微系统具有更高的角度控制分辨率；(3)样品和显微物镜同步反馈控制，能够保证样品处于旋转全内反射显微系统的最佳照明面和最佳成像面，具有更好的照明均匀性和成像分辨率。附图说明图1为本专利技术一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置的结构示意图。图2为位置探测器探测到的光斑形状以及对应状态。图3系统控制信号图。具体实施方式下面结合实施例和附图来详细说明本专利技术，但本专利技术并不仅限于此。如图1所示，一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：激光器1、第一准直透镜2、二维扫描系统3、扫描透镜4、第二准直透镜5、“X”型分束镜6、二色镜7、显微场镜8、显微物镜9、样品10、滤光片11、CCD12、聚焦镜13、位置探测校准CCD14和主控计算本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种带反馈的旋转全内反射显微装置，其特征在于，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、“X”型分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，使第一光点与第二光点重合，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的CCD。
【技术特征摘要】
1.一种带反馈的旋转全内反射显微装置，其特征在于，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、“X”型分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，使第一光点与第二光点重合，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的CCD。2.如权利要求1所述的旋转全内反射显微装置，其特征在于：所述的二维扫描振镜位于扫描透镜的后焦面上，扫描透镜与准直透镜构成4f系统，准直透镜与全反射显微物镜构成4f系统。3.如权利要1所述的带反馈的旋转全内反射显微装置，起特征在于：所述的“X”型分束镜的透反比为90％以上。4.一种基于权利要求1～3任一项所述旋转全内反射显微装置...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，修鹏，匡翠方，许迎科，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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