本发明专利技术提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了该序列的用途及一种检测齐口裂腹鱼细菌感染的试剂盒。本发明专利技术提供的核苷酸序列可作为检测齐口裂腹鱼细菌感染的辅助生物标记物，通过检测齐口裂腹鱼群血液、肝胰脏、中肾和/或脾脏组织的Hsp60mRNA表达水平，可以筛查齐口裂腹鱼被细菌感染的风险，临床应用前景良好。
CDNA full length sequence of HSP60 gene from the common cleft abdomen and its use
The invention provides a SEQ ID as shown in the NO:1 nucleotide sequence. The present invention also provides the use of the sequence and a kit for detecting the bacterial infection of the fish. The invention provides a nucleotide sequence can be used to detect prenanti Schizothoracinae auxiliary biomarkers of fish bacterial infection, by detecting all Schizothoracinae fish blood, liver, kidney and / or spleen tissue Hsp60mRNA expression levels can risk screening of Schizothorax prenanti was bacterial infection, a good prospect of clinical application.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种齐口裂腹鱼HSP60基因的cDNA全长序列及其用途。
技术介绍
齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)俗称雅鱼，是雅安三绝之一，属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属鱼类，分布于长江上游、大渡河、岷江、青衣江、金沙江及乌江下游等水域。齐口裂腹鱼具有肉质细嫩、味道鲜美、营养价值丰富的特点，是我国名特优水产养殖鱼类，备受消费者青睐。近10多年来，该鱼作为一种新兴的水产养殖种类，在四川、贵州和重庆等快速发展,并逐渐形成具有地方优势特色的产业。但随着齐口裂腹鱼养殖规模与养殖密度的不断提高，细菌性疾病的发生日益严重，给齐口裂腹鱼养殖业带来巨大的经济损失。尤其是近年来在主要养殖区流行的由无乳链球菌感染引起的齐口裂腹鱼爆发性传染病，以突眼、体表出血和神经症状为临床特征，具有发病率和死亡率高的特点。2013年8月，四川雅安养殖场爆发了无乳链球菌病，发病率高达50％，病死率达100％，给养殖户造成极为严重的损害。目前，临床上检测齐口裂腹鱼感染无乳链球菌的方法，主要依靠对患病样品中病原微生物学分离、培养和生化试验等进行鉴定，但这种方法是在已明确发现齐口裂腹鱼细菌感染时进行，不利于病情控制。控制齐口裂腹鱼感染无乳链球菌最好的办法是预防和早期诊断，做到早发现、早隔离、早治疗，防止无乳链球菌病蔓延，保证齐口裂腹鱼健康养殖。热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)又名热应激蛋白，是机体在应激情况下细胞内迅速合成的一组蛋白质，在机体遭受热应激、低氧胁迫、重金属和微生物感染等胁迫中能快速作出响应，普遍存在于整个生物界。Hsp60是已知HSP家族中的一员，可以作为分子伴侣，参与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质的组装和转运。在鱼类中Hsp60的研究起步较晚，目前的研究主要集中在温度和物理化学因素对Hsp60的应激方面。目前未见齐口裂腹鱼HSP60基因的报道，更未见齐口裂腹鱼HSP60与病原体感染相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种齐口裂腹鱼HSP60基因的cDNA全长序列及其用途。本专利技术提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种齐口裂腹鱼HSP60蛋白，其特征在于，它是由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。进一步地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本专利技术还提供了上述核苷酸序列、上述蛋白在制备检测齐口裂腹鱼细菌感染的试剂中的用途。其中，所述试剂为检测齐口裂腹鱼血液、肝胰脏、中肾和/或脾脏的Hsp60核苷酸表达水平的试剂。其中，所述细菌感染为无乳链球菌感染。本专利技术还提供了一种检测齐口裂腹鱼细菌感染的试剂盒，其特征在于，它包含用来扩增SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的试剂。其中，所述试剂包含序列如SEQ ID NO：4-5所示的引物对。其中，所述试剂为检测齐口裂腹鱼血液、肝胰脏、中肾和/或脾脏的Hsp60核苷酸表达水平的试剂；其中，所述细菌感染为无乳链球菌感染。本专利技术人克隆得到了齐口裂腹鱼Hsp60的cDNA全序列，并且发现齐口裂腹鱼Hsp60的表达水平与齐口裂腹鱼是否受细菌感染相关：例如齐口裂腹鱼在受细菌感染的急性期、早期和中期，肝胰脏的Hsp60表达量均显著提高，随后表达量显著降低；而脾脏中的Hsp60表达量与肝胰脏中趋势完全相反。综上，本专利技术发现Hsp60可作为诊断细菌感染的靶标，用于制备细菌感染的检测试剂，尤其是无乳链球菌感染。本专利技术包含检测齐口裂腹鱼Hsp60的表达水平的试剂盒，可用于早期监控和检测齐口裂腹鱼细菌感染，实施早期预防和诊断，减少对齐口裂腹鱼造成的损害，临床应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为总RNA凝胶电泳图，其中，1、2泳道为鳃，3泳道为脾脏，4、5泳道为中肾。图2为Sp Hsp60基因扩增图，其中，图2a为保守区域扩增图，图2b为5’端扩增图，图2c为3’端扩增图；泳道M:2000DNA Marker,泳道1:扩增产物。图3为Sp Hsp60全长cDNA序列及预测氨基酸序列图，其中，单横线表示ATP/ADP绑定位点，双横线表示Mg2+连接位点，虚线表示底物结合位点，黑色方框表示GGM重复模序，星号(*)表示终止密码子。图4为Sp Hsp60的组织分布图，其中，Sk：皮肤，Mu：肌肉，In：肠，Tk：中肾，Sp：脾脏，Br：脑，He：心脏，Gi：鳃，Bl：血液，Hep：肝胰脏。a-f表示表达量显著性变化(*P<0.05)，实验结果是通过β-actin和18S rRNA作为内参进行校准，校准数据经过最大值归一处理，误差线表示标准误(n＝5尾/组)。图5为Sp Hsp60mRNA在齐口裂腹鱼组织中的表达量变化图，其中，○表示感染组，■表示对照组，*表示在同一时间点实验组与对照组的表达量有显著性差异(P<0.05)。β-actin和18S rRNA作为内参进行校准，每个组织的校准数据单独进行最大值归一处理，误差线表示标准误(n＝8尾/组)。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。实施例1 齐口裂腹鱼Hsp60基因的cDNA克隆一、试验材料1、菌体/载体大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α感受态细胞(购自于天根生化科技有限公司，北京，中国)；pMD19-T(购于宝生物工程公司，大连，中国)。2、试验动物健康齐口裂腹鱼购于四川润兆渔业有限公司。3、主要试剂(1)Sanprep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒、样品RNA/DNA保护剂、RNAiso Plus裂解液、PrimeScriptTM Reagent Kit(Perfect Real Time)cat#RR037A(购于宝生物工程公司，大连，中国)。(2)2×Taq Master Mix、Goldview、琼脂糖、DNA Marker(DL2000、DL1000DNA Marker)(购自于天根生化科技有限公司，北京，中国)。(3)SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(购于BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA,USA)4、主要仪器WaterPro Plus超纯水仪(LABCONCO公司)；Mis-3780型全自动高压灭菌锅(Sanyo公司)；Allegra21R型高速冷冻离心机(Thermo公司)；C1000Thermal Cycler PCR扩增仪(Bio-Rad公司)；Gel Doc 2000凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)；核酸检测仪(Bio-Rad公司)；Mini-SUB凝胶电泳装置(Bio-Rad公司)；725型超低本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。3.一种齐口裂腹鱼HSP60蛋白，其特征在于，它是由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。4.根据权利要求3所述的HSP60蛋白，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。5.权利要求1或2所述核苷酸序列、权利要求3或4所述HSP60蛋白在制备检测齐口裂腹鱼细菌感染的试剂中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂为检测齐口裂腹鱼血液、肝胰脏、中肾和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈德芳，蒲云丹，王虹，彭爽，李志琼，汪开毓，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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