基于"石英杯中激发型"流式细胞分选仪的染色体分选方法技术

本发明专利技术提供了一种基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法。进一步地，本发明专利技术提供了用于分选的染色体样品的制备方法。所述方法包括将制备的Hoechst 33258和色霉素A3染色后的染色体悬液在基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪上分选，其中使用的UV和444nm激光器功率分别为50mW和20mW，获得了高分辨率的二变量流式核型图，并分选得到了高纯度的染色体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及染色体分选的
具体地，本专利技术涉及基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法，以及用于染色体分选的染色体样品制备的方法。
技术介绍
高纯度的染色体已经被用于制备染色体涂染探针[1,2]，产生特异的DNA文库[3,4]，微阵列[5,6]等方面。流式核型图是基于不同染色体的DNA含量和碱基组成差异的基础上而产生的[7]。Hoechst 33258染料优先结合到AT-富集的序列，而色霉素A3(Chromomycin A3)优先结合到GC-富集的序列[7]。这两种染料的特点能够分辨绝大部分人的染色体，除了染色体9、10、11和12簇，因为它们具有相似的DNA含量和碱基组成[7]。染色体分选技术就是将染色体用Hoechst 33258(简称HO)和色霉素A3(简称CA3)进行双荧光素标记，经过流式细胞分选仪进行分离、纯化、富集特定染色体的技术。本专利技术中所提到的染色体分选技术指HO和CA3双荧光标记样品的分选技术，简称为“染色体分选”。目前的染色体分选都是通过使用MoFlo、Vantage SE、BD Influx等“空气中激发原理型”流式细胞分选仪得以实现。Bee L.Ng等发现用MoFlo流式细胞仪分选人类淋巴母细胞系的染色体，两个水冷的氩离子激光器，分别是UV激光器(330–360nm)和蓝紫色激光器(波长458nm)都设为300mW时，才能得到较好分辨率的二维流式核型图，以实现较好的分选效果[8]。这种“空气中激发原理型”设备的不足之处是荧光素在空气中被激发出来，产生的荧光信号能量损失较大。由于染色体尺寸较小，为了能够在流式细胞分选系统中检测到荧光信号，需要使已标记在碱基上的荧光素分子以最高能量被激发出来，同时尽量避免荧光信号的损失。目前的染色体分选设备都配备了大功率激光器，价格很昂贵。目前使用MoFlo、Vantage SE、BD Influx等“空气中激发原理型”流式细胞分选仪的染色体分选具有技术难度大、并非属常规技术、检测水平参差不齐的缺陷。因而，在我国国内至今尚未真正开展起来。依我们了解中科院昆明动物所曾经利用“空气中激发原理型”流式细胞分选仪(BD Vantage SE)尝试着做染色体分选技术，当时初步获得过人的染色体流式核型图，但始终没有分选出来目的染色体，仅停止于染色体的分析过程，之后再也没有人开展这项技术的进一步研究。因此在国内尚没有真正开展起来双参数染色体分选技术，至今列为“空白技术”。国内对该技术需求越来越多，但一直得不到满足，因此目前需要开发一种操作简便、技术稳定可靠、重复性好的染色体分选方法。为实现这一目的，我们做了多方面努力。首先，为准备硬件条件提前订购特殊配置型流式细胞分选仪。BD Aria系列产品的核心技术是采用“石英杯流动池”和“全反射型信号检测器”，荧光物质在石英杯中被激发出来，光信号损失小。因此我们推测如果把这种高灵敏度分选仪应用于染色体分选技术中检测效果可能会更理想，胜于上述“空气中激发型”细胞分选仪。因所有商品化BD Aria系列的流式细胞分选仪均不具备染色体分选的配置，所以我们根据自己的应用需求预先设计好了光路配置，委托美国BD Bioscience公司特殊订制了一款“石英杯中激发型”流式细胞分选仪-BD Aria SORP，属于BD Aria系列中高端订制型产品。这个设备中激光器的类型、功率大小、信号检测器类型、滤光片组合等光路配置均按照我们的个性化思路设置，有别于商品化的AriaⅡ、AriaⅢ等标配型产品。而“石英杯流动池”以及全反射型信号检测器原理是BD厂家的专利，已被广泛应用于所有Aria系列产品中。第二，我们进行了染色体分选样品制备技术的探索。流式核型图的分辨率依赖于染色体制备和流式细胞仪的检测灵敏度[8]。合格的样品是染色体分选技术成功的基础，但是染色体的分选样品制备技术难度很大，目前国内几乎没有人能提供合格的染色体分选样品。样品制备过程较复杂，首先制备出大量的游离染色体是最关键的步骤，这里需要摸索细胞周期“同步化”、低渗、荧光标记等一系列条件，我们经过优化条件建立了稳定、高效的染色体制备方法。第三，染色体分选检测技术的探索。必须利用事先准备好的合格的染色体样品，才能开始反复地探索染色体分选操作技术，包括复杂的光路、液路的精细调节过程，最终获得染色体二变量流式核型图，而且根据每条染色体的分辨率进一步纯化、分离和富集特定的染色体。我们也已经摸索到了最稳定的仪器参数设定，在这台设备上了得到了高分辨率的二变量流式核型图，并实现了高纯度的染色体分选技术。本专利技术中我们利用“石英杯中激发型”流式细胞分选仪实现了小鼠和人类细胞染色体分选技术，我们使用的设备有别于目前惯用的“空气中激发型”设备，首次用“石英杯中激发型”流式细胞分选仪(如Aria SORP)实现了染色体的分选。我们的研究已经证明，使用Aria SORP的染色体检测灵敏度高于现有技术中的“空气中激发型”设备，如MoFlo或Vantage SE，并且我们的检测水平已达到甚至超越现有技术中的检测水平。检测技术稳定、可靠、重复性好。在本专利技术中，我们采用低激光功率，其中UV激光器功率是50mW、蓝紫色的444nm激光器功率是20mW，仅仅是“空气中激发型”设备(300mW)的1/6和1/15激光功率，避免了使用价格昂贵的大功率激光器。而检测到的染色体分辨率已达到与现有技术的同等水平，甚至更高，如首次实现了人的12号染色体的成功分离。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪(如Aria SORP)的染色体分选方法，其中“石英杯中激发型”流式细胞分选仪使用的UV和444nm激光器功率分别为50mW和20mW，而目前现有技术中采用的两个激光功率均300mW以上；而且在本专利技术的方法中，荧光素的激发部位在“石英杯”中，而现有技术中报道的荧光素在“空气”中激发。本专利技术证实了本专利技术的基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法灵敏度高。一种基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法，所述方法包括以下步骤：i)离心收获的细胞，悬浮培养于低渗液中；ii)离心i)获得的悬浮液，将细胞重悬于冰冻的多胺分离液中；iii)剧烈涡旋震荡ii)获得的细胞悬浮液，离心，过滤筛选；iv)步骤iii)获得的染色体悬液与Hoechst 33258和色霉素A3过夜孵育染色；v)染色后的染色体悬液与柠檬酸钠和亚硫酸钠冰上孵育；vi)将步骤v)获得的染色后的染色体悬液在基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪上分选，其中“石英杯中激发型”流式细胞分选仪使用的UV和444nm激光器功率分别为50mW和20mW。根据本专利技术所述的方法，其中所述低渗液含有75mM KCl,0.2mM精胺,0.5mM亚精胺和10mM MgSO4·7H2O，pH 8.0。根据本专利技术所述的方法，其中所述多胺分离液含有15mM Tris,2mM EDTA,0.5mM EGTA,80mM KCl,3mM二硫苏糖醇,0.25％Triton X-100,0.2mM精胺和0.5mM亚精胺，pH 7.5。根据本专利技术所述的方法，其中所述Hoechst 33258为5μg/ml和色霉素A3为50μg/m。根据本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法，所述方法包括以下步骤：i)离心收获的细胞，悬浮培养于低渗液中；ii)离心i)获得的悬浮液，将细胞重悬于冰冻的多胺分离液中；iii)剧烈涡旋震荡ii)获得的细胞悬浮液，离心，过滤筛选；iv)步骤iii)获得的染色体悬液与Hoechst 33258和色霉素A3过夜孵育染色；v)染色后的染色体悬液与柠檬酸钠和亚硫酸钠冰上孵育；vi)将步骤v)获得的染色后的染色体悬液在基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪上分选，其中“石英杯中激发型”流式细胞分选仪使用的UV和444nm激光器功率分别为50mW和20mW。

【技术特征摘要】
1.一种基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪的染色体分选方法，所述方法包括以下步骤：i)离心收获的细胞，悬浮培养于低渗液中；ii)离心i)获得的悬浮液，将细胞重悬于冰冻的多胺分离液中；iii)剧烈涡旋震荡ii)获得的细胞悬浮液，离心，过滤筛选；iv)步骤iii)获得的染色体悬液与Hoechst 33258和色霉素A3过夜孵育染色；v)染色后的染色体悬液与柠檬酸钠和亚硫酸钠冰上孵育；vi)将步骤v)获得的染色后的染色体悬液在基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪上分选，其中“石英杯中激发型”流式细胞分选仪使用的UV和444nm激光器功率分别为50mW和20mW。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低渗液含有75mM KCl,0.2mM精胺,0.5mM亚精胺和10mM MgSO4·7H2O，pH 8.0。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多胺分离液含有15mM Tris,2mM EDTA,0.5mM EGTA,80mM KCl,3mM二硫苏糖醇,0.25％Triton X-100,0.2mM精胺和0.5mM亚精胺，pH 7.5。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述Hoechst 33258为5μg/ml和色霉素A3为50μg/m。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪中的UV激光检测器选择390nm滤光片、444nm激光器选择LP 475nm滤光片。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中基于“石英杯中激发型”流式细胞分选仪具体参数设置如下：喷嘴：选择70μm；激光功率：UV激光功率选择50mW、444nm激光功率选择20mW；特殊滤光片：UV激光检测器选择390nm滤光片、444nm激光器选择LP 475nm滤光片；激光延迟时间和面积因子：用rainbow微球精准调节UV激光和444nm激光器的延迟时间和面积因子，使得相应通道的信号达到最大；变异系数CV：通过激光光斑等硬件调节使UV和444nm激光器的CV值＜1.0，越小越好；获取模板的设置、“设门”：分别画出以下几个图，FSC vs SSC...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴后男，黄粤，贾玉艳，刘云，
申请(专利权)人：北京大学，中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11