烟草甾醇突变体的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。本发明专利技术筛选方法操作简单、成本低、效率高，可适用于大量突变体和群体单株筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及烟草
，尤其是一种烟草甾醇突变体的筛选方法。
技术介绍
植物甾醇是植物性甾体化合物，其结构类似于动物性甾醇，广泛存在于植物根、茎、叶、果实和种子中，其基本结构为环戊氢化菲体系。植物甾醇不仅是植物细胞的重要组成成分，也是一种重要的植物活性成分。研究发现植物甾醇不仅参与植物的生长发育调控,而且通过植物甾醇含量的相对变化响应各种生物胁迫和非生物胁迫,如病原体、干旱、盐碱、极端温度、低氧、光照、ABA和UV-B等。植物甾醇作为信号分子参与逆境胁迫反应，在植物中发挥重要作用，被誉为“生命的钥匙”。此外，植物甾醇具有重要的药用价值，对人类生活具有重要意义。目前已经研究证明植物甾醇可以促进胆固醇的异化，抑制胆固醇在肝脏内的生物合成和在肠道内的吸收，从而预防心血管疾病；胆固醇作为细胞膜的主要成分，参与血液中脂质的运输；β-谷甾醇等植物甾醇能够阻断致癌物诱发癌细胞的形成，因而对大肠癌、皮肤癌、宫颈癌的发生具有一定程度的抑制作用。植物甾醇促进人体内新陈代谢，与肾小管的重吸收作用有关，维持第二性征。植物甾醇在体内能表现出一定的激素活性，但却无激素的副作用。当人体激素水平高于正常值时，植物甾醇能够阻碍胆激素吸收的作用，降低人体激素水平；当人体激素水平低于正常值时，植物甾醇会转化成人体内的激素，提高人体激素水平。目前烟草中已报道植物甾醇主要有胆甾醇，菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇。烟草中的植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草安全、品质都有较大的影响。研究表明，烟草中的甾醇是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[α]芘是由甾醇裂解产生的。在卷烟抽吸时约有20％-25％的烟草植物甾醇完整的转移到主流和侧流烟气中，甾醇中的羟基，高温热解时会与其母体的四轮环戊烯[α]菲环结构形成稠环芳烃化合物。Stedman的研究表明豆甾醇在750℃下热解生成苯并[α]芘；Badger表明，在豆甾醇的裂解过程中，发生了甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲，蒽等多环芳烃。因此，获得甾醇突变体植株对培育高品质、低危害烟草品种以及植物甾醇活性物质提取研究都具有重要意义。但是，目前烟草中甾醇的分析方法主要采用定量分析法，该方法样品前期需要经过多个工序处理，致使其测定周期较长，步骤繁琐，不适用于大批量材料的筛选。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提出一种烟草甾醇突变体的筛选方法，操作简便，实施效果好。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。优选的，步骤⑴为：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液作为溶剂，配置体积浓度为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液；将烟草种子加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26℃、110rpm的摇床内，处理16小时。优选的，摇床处理后的种子，用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液每隔半小时润洗一次，洗3次后用蒸馏水冲洗2h。优选的，步骤⑶包括：①、配制100μM伏立康唑溶液；②、1/2MS培养基配制：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用；③、设置梯度浓度：将梯度浓度的伏立康唑溶液分别加入1/2MS培养基中，得到梯度浓度的伏立康唑的1/2MS培养基。优选的，烟草种子为红花大金元。优选的，步骤⑶的浓度梯度为0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ和10μΜ。优选的，步骤⑷或步骤⑸中，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度为：1μM和3μM。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：利用不同浓度伏立康唑的1/2MS培养基探索红花大金元对伏立康唑的敏感性，从而筛选出红花大金元正常生长和生长受到抑制时伏立康唑的临界浓度，其次，利用上述临界浓度，筛选红花大金元EMS突变体，获得烟草低甾醇含量突变体和烟草高甾醇含量突变体。该方法能够对烟叶总甾醇物质进行定性检测，筛选方法操作简单、成本低、效率高，可适用于大量突变体和群体单株筛选。附图说明图1为甾醇抑制剂福利康挫筛选红花大金元；图2为甾醇抑制剂福利康挫筛选红花大金元突变体。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本专利技术的保护范围有任何的限制作用。一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：1)用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(sthyl methyl sulfonate，EMS)处理烟草种子，获得M1代种子；2)对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；3)制备含不同浓度甾醇抑制剂伏立康唑(Voriconazole)的1/2MS培养基。首先，配制1 00μM伏立康唑溶液：称取0.01g伏立康唑，加入286ml无菌水，混匀，棕色瓶保存备用。其次，配制1/2MS培养基：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用。最后，设置梯度浓度：根据实验要求设计含有不同浓度伏立康唑的梯度1/2MS培养基。4)利用含0.00μΜ(对照)、0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ伏立康唑的1/2MS培养基，探索不同浓度伏立康唑抑制烟草红花大金元的生长情况。5)甾醇含量的突变体的筛选。利用摸索好的适宜浓度的甾醇抑制剂伏立康唑的1/2MS培养基从烟草突变体中筛选低甾醇含量的突变体。本专利技术利用筛选出的临界浓度对EMS诱变的红花大金元500个M2代家系进行筛选，获得高伏立康唑浓度下正常生长的突变体和低伏立康唑浓度下生长受到抑制的突变体材料。最后参照《衍生化气相色谱质谱联用法同时测定烟叶多种植物甾醇》定量测定烟草品种红花大金元和伏立康唑法筛选获得的突变体单株中菜油甾醇、豆甾醇和β谷甾醇的含量，以此验证伏立康唑法定性筛选甾醇突变体的准确性。伏利康唑能够通过抑制细胞色素P450依赖性14-α-固醇去甲基酶的活性，进而抑制功能性真菌膜的形成和维持真菌生长的甾醇的生物合成，使得细胞膜合成受阻，细胞破裂死亡。伏立康唑的植物生长调控特性和相关的苯三唑被鉴定具有抑制包括模式生物拟南芥在内的大多数双子叶植物和单子叶植物体内甾醇生物合成的能力，进而影响植物生长发育。烟草甾醇突变体的筛选和深入研究，有助于深入认识甾醇合成代谢途径的分子机理。通过筛选甾醇合成代谢突变体，高甾醇突变体材料可以作为生物反应器提取甾醇作为药物生产原料；低甾醇突变体材料可以用于培育低害烟草品种。本专利技术具体操作步骤如下：(1)种子诱变处理：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液(Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·H2O)作为溶剂，配置浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。2.如权利要求1所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：步骤⑴为：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液作为溶剂，配置体积浓度为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液；将烟草种子加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26℃、110rpm的摇床内，处理16小时。3.如权利要求2所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：摇床处理后的种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明丽，龚达平，刘贯山，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37