一类蔗糖酯型阳离子基因载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一类蔗糖酯型阳离子类脂及其制备方法。利用该阳离子类脂制备的载体可用于核酸递送。本发明专利技术运用化学合成的方法制备了蔗糖酯型阳离子类脂，合成方法简单，产物收率较高。本发明专利技术的蔗糖酯型阳离子类脂化合物与类脂助剂混合，可制备包括悬浮液，乳浊液，微胶粒和脂质体等组合物。利用上述组合物可与核酸制备蔗糖酯型阳离子类脂复合物，其具有制备简单、低毒、转染效率高等优点，是一种新型的高效基因载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物及其制备方法，该类化合物可制备蔗糖酯型阳离子类脂组合物和复合物并用于核酸递送。
技术介绍
近年来，人们专利技术了很多治疗疾病的新方法，但是对于癌症等疾病的治疗还没有有效的治疗方法。而基因治疗作为一种全新的和革命性的治疗手段，是治愈癌症、心血管疾病和先天性免疫缺陷等疑难疾病的潜在方法。然而，其核心技术—基因转运的难题一直限制着基因治疗的发展和临床试验，其中，获得高效、安全的基因转运载体无疑成为基因治疗成功与否的关键。目前，全世界使用的基因转运载体主要为两大类：一类为病毒载体，另一类为非病毒载体。病毒基因载体是利用病毒侵染细胞的能力，以病毒为基础构建的一种运载基因的载体，与此相对应，不使用病毒进行基因转运的载体统称为非病毒基因载体。虽然病毒基因载体用于基因的转运具有效率高的优点，但存在免疫原性高、容量小、变异性和致癌性等缺点。而非病毒基因载体以其设计灵活、低毒性、低免疫原性、低致肿瘤性、易制备及可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点，为基因治疗开辟出一条新的道路。到目前为止，在2000余例的基因治疗临床试验中，有接近三分之一是通过非病毒基因载体来实施的。然而，非病毒基因载体的转染效率与病毒载体相比还有一定的差距，成为制约其临床试验的瓶颈。开发高效、低毒的非病毒基因载体已成为基因治疗的重要研究内容之一。阳离子脂质体作为非病毒基因载体中的一类因其制备简便，无免疫原性、可重复转染和易于商品化等优点，近年来得到了迅速的发展。1987年Felgner等人(PNAS1987,84:7413–7417)首次将阳离子类脂DOTMA制备成阳离子脂质体转运DNA，开创了阳离子脂质体在基因治疗领域的先河。由阳离子类脂所形成的脂质体的结构与生物膜相似，用它作为一种载体可包裹外源基因。阳离子脂质体在生理pH值下带有正电荷，能够借助静电作用与核酸分子中的带有负电性的磷酸基团自组装形成脂质体/基因复合物，再通过静电作用吸附于细胞表
面，进而通过细胞内吞作用或其他作用将外源基因导入细胞，从而发挥基因的治疗作用。自1987年以来，人们已经设计合成了许多阳离子类脂并用于核酸递送(Focus 1993,15:73–83)。但是现有阳离子类脂毒性较高，且转染效率有待提高。众所周知，糖类化合物在自然界中分布较为广泛，安全性高。蔗糖为原料制备成的蔗糖酯在水相中能形成囊泡状或双片层结构，具有良好的生物相容性和降解性。但是由于蔗糖中羟基基团很多，所以很难通过化学合成方法得到单一结构的蔗糖酯化合物(J.Am.Oil Chem.Soc.2014,91:1891-1901.)，到目前为止尚未有蔗糖酯型基因载体应用于基因载体的相关研究。因此，研究和开发生物相容性好、高效和低细胞毒性的蔗糖酯型基因载体，对于开发具有自主知识产权的基因载体具有重要的科学意义和经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类安全高效的蔗糖酯型阳离子基因载体及其制备方法，其主要包括：一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物及其制备方法、一类蔗糖酯型阳离子组合物及其制备方法及一类蔗糖酯型阳离子类脂复合物及其制备方法。除了另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。本文中使用的术语“烃基”包括烷基、烯基和炔基。本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。例如“C1-4烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其他基团。本专利技术中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。一、本专利技术的蔗糖酯型阳离子类脂化合物，具有通式I的结构：其中：R选自C10-20烃基酯、胆汁酸基和胆固醇酯基；其中所述胆固醇酯基(B1)结构如下：在优选的技术方案中，R优选选自C12-18烷基酯、十八烯基酯(C17H34COO-)、胆汁酸基和胆固醇酯基。更优选R选自C12烷基酯、C14烷基酯、十八烯基酯(C17H34COO-)和胆固醇酯基。Y选自–NRaRb和–N+RaRbRcXˉ，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，并且选自氢、C1-6烃基、C1-6羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或叶酸酯基；Xˉ选自Fˉ、Clˉ、Brˉ、Iˉ。在优选的技术方案中，Y优选选自NRaRb，其中Ra和Rb优选选自C1-6烷基、C1-6羟烷基、C6H11O6-(半乳糖基)、C6H11O6-(甘露糖基)和叶酸酯基(C18H18N7O4COOCH2CH2-)；更优选Ra和Rb选自甲基、乙基、羟甲基、羟乙基、半乳糖基和叶酸酯基；其中所述半乳糖基(B2)、甘露糖基(B3)、叶酸酯基(B4)的结构如下：二、上述一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)三氯蔗糖和式ⅰ的化合物按照摩尔比1:1～50反应，制备化合物A：反应温度为10～100℃，反应时间为10～50h，反应溶剂为如N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、乙腈、哌啶、三乙胺等含氮溶剂，反应物与溶剂的质量体积比为1:1～50；在一个优选的实施方案中，反应温度为10～70℃，反应时间为10～35h，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和吡啶，三氯蔗糖和式ⅰ的化合物的摩尔比1:1～1:20；在一个更优选的实施方式中，反应温度为30～60℃,反应时间为20～30h，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和吡啶，三氯蔗糖和式ⅰ的化合物的摩尔比1:1～1:10。(2)化合物A和式ⅱ的化合物按照摩尔比1:1～8反应，制备化合物B：具体操作如下：a分别在容器中加入三氯蔗糖酯，再取一定量式ⅱ化合物加入容器中，反应温度为10～120℃，反应时间为10～40h，反应压力为1.0～5.0atm，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、异丙醇或异丁醇，反应物与溶剂的质量体积比为1:1～50；b反应结束后，减压蒸馏除去未反应的原料，所得即为反应粗产物。c将粗产物经柱色谱分离提纯得到产物后以溶剂溶解结晶数次，得到淡黄色粉末状固体，即为化合物B。在一个优选的实施方式中，反应温度为50～110℃,反应时间为10～35h,反应压力为1.0～3.0atm，反应溶剂为DMF、乙醇或异丙醇，化合物A和式ⅱ的化合物的摩尔比为1:1～1:6；在一个更优选的实施方式中，反应温度为80～105℃,反应时间为15～25h,反应压力为1.0～2.0atm，反应溶剂为乙醇或异丙醇，化合物A和式ⅱ的化合物的摩尔比为1:1～1:3。当所合成的产物为季铵盐时，平衡阴离子Fˉ、Brˉ、Iˉ可以通过离子交换柱替换Cl-获得。上述对本专利技术的一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物的制备方法的描述中，各个取代基的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。三、本专利技术的蔗糖酯型阳离子类脂组合物，该组合物是由上述的蔗糖酯型阳离子类脂化合物和类脂助剂组成，所述的蔗糖酯型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为10:1～1:10。在优选的技术方案中，蔗糖酯型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为5:1～1:5,更优选的质量比为3:1～1:3。所述类脂助剂选自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、糖脂、二油酰磷脂酰氯(DOPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)、壳聚糖、蔗糖酯中的一种或两种以上的混合物。在优选的技术方案中，类脂助剂选自卵磷脂、DOP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物，其特征在于：具有通式I的结构：其中：R选自C10‑20烃基、胆汁酸基和胆固醇酯基；Y选自–NRaRb和–N+RaRbRcXˉ，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，并且选自氢、C1‑6烃基、C1‑6羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或叶酸酯基；Xˉ选自Fˉ、Clˉ、Br‑、I‑。

【技术特征摘要】
1.一类蔗糖酯型阳离子类脂化合物，其特征在于：具有通式I的结构：其中：R选自C10-20烃基、胆汁酸基和胆固醇酯基；Y选自–NRaRb和–N+RaRbRcXˉ，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，并且选自氢、C1-6烃基、C1-6羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或叶酸酯基；Xˉ选自Fˉ、Clˉ、Br-、I-。2.权利要求1的蔗糖酯型阳离子类脂化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)三氯蔗糖和式ⅰ的化合物按照摩尔比1:1～50反应，制备化合物A：反应温度为10～100℃，反应时间为10～50h，反应溶剂为如N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、乙腈、哌啶、三乙胺等含氮溶剂，反应物与溶剂的质量体积比为1:1～50；式ⅰ的化合物选自C10-20烃基酸、胆汁酸或胆固醇基酸。(2)化合物A和式ⅱ的化合物按照摩尔比1:1～8反应，制备化合物B：反应温度为10～120℃，反应时间为10～40h，压力为1.0～5.0atm，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或异丁醇，反应物与溶剂的质量体积比为1:1～50；式ii的化合物中Ra、Rb和Rc相同或不同，并且选自氢、C1-6烃基、C1-6羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或叶酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树彪，支德福，崔韶晖，赵轶男，周泉，
申请(专利权)人：大连民族学院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21