用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸制造技术

本发明专利技术一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个支撑层，支撑层的上侧面上设置有吸附层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，检测线由抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，质控线由羊抗或兔抗小鼠IgG抗体、或羊抗兔IgG抗体构成，荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，荧光抗体由FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。本发明专利技术还公开了上述夹心型免疫层析试纸的制备方法。本发明专利技术的试纸检测方法简单，特异性强，灵敏度高，直观，准确，最低可检测1CFU/mL的痕量污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及一种免疫层析试纸，特别是一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸。
技术介绍
大肠杆菌O157:H7型(Escherichia coli O157:H7)是一种肠道出血性大肠杆菌，是主要食源致病菌之一。由大肠杆菌O157:H7引起的肠道感染性疾病已经成为全球关注的公共卫生问题。大肠杆菌O157:H7感染能引起出血性结肠炎(HC)，阑尾炎和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，严重的可引起血栓性血小板紫癜(TTP)和溶血性尿路综合症(HUS)等全身性并发症，其中3-5％病人死亡，约有12％病人有严重的后遗症。而且人的感染剂量极低，摄入10-100个活菌就可引起发病。近年来，大肠杆菌O157:H7在我国食品样本，尤其是动物肉制品中检出率较高。在福建、北京、广东等省市的多种食品中都检测到了该菌。大肠杆菌O157:H7对外界环境具有较强适应性，对温度、pH和干燥有一定的抗性，可以在食物、沙土、水、肥料和人工微环境中存活长达数月。目前大肠杆菌O157:H7快速检测方法主要包括生化方法、分子生物学方法、生物传感器、代谢学方法和免疫学方法等。生化方法耗时耗力，而且容易漏检自然变异株。分子生物学方法由于其操作复杂对设备依赖度高，加之检测的准确性和重复性有待提高等原因，故在致病菌的检测、诊断领域尚未得到广泛应用。生物传感器检测技术与传统的检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，但它往往需要光学或化学原件，检测需要仪器辅助，检测成本较高。代谢组学方法方便、灵敏，具有极大的应用潜力，但只能用于菌落总数鉴定，不能用于菌种鉴定。免疫学方法是基于抗原-抗体的特异性结合反应发展而成的蛋白质水平上的系列检测方法，主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、乳胶凝集反应、免疫层析技术和蛋白芯片技术。免疫层析试纸技术在检测速度和方便性是最为优越的免疫学检测方法。免疫层析试纸目前的主要发展方向是提高灵敏度、定量检测和多元检测。针对灵敏度问题目前所采用的方法归为两类：采用纯度高、亲和力强的单克隆抗体和采用新型标记物。上转换荧光纳米颗粒、量子点和荧光微球等为代表的新型发射光谱型标记物，光学特性优良，纳米材料发光强度高，将它们功能化后与致病菌抗体的氨基偶联，形成稳定的发光复 合体，借助特定光源通过检测光信号强度便可将灵敏度得以一定程度的提高。但这些新材料的制备工艺较复杂，成本较高，原材料难以获取，离实际应用距离甚远。荧光标记物FITC是目前应用最为广泛的荧光素，它的最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长为525-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在pH为9.0-9.5的条件下可与氨基进行反应形成硫脲，FITC荧光标记技术较为成熟，标记方法简单易行，但其作为标记物应用于免疫层析试纸并未研究。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，所述的这种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸要解决现有技术中检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法灵敏度不高、检测时间长、检测过程复杂的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层的上侧面上设置有吸附层，所述的吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述的吸附纤维层和应该抗体纤维层紧密连接，所述的荧光抗体纤维层和所述的纤维素膜层紧密连接，所述的纤维素膜层和所述的吸水材料层紧密连接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，所述的检测线由抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述的质控线由羊抗或兔抗小鼠IgG抗体、或羊抗兔IgG抗体构成，所述荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，所述的荧光抗体由FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。进一步的，所述的吸附层的上端设置有保护层，进一步的，所述的FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：(1)一个配置交联反应液的步骤，在每升反应液中加入7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3和7.36g NaCl，余量为超纯水，将纯化后的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体于4℃对交联反应液中透析2～4次，至pH＝9.0；(2)将透析后的反应液转移至反应容器中，放于磁力搅拌器上，按照抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体：FITC的量为1mg:150μg的比例滴加FITC的DMSO溶液，避光，4℃反应过夜，加入5mol/L的NH4Cl 4℃至终浓度为5mmol/L，终止反应2h；(3)将交联物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮，4℃暗处保藏备用。进一步的，所述的吸附纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中 的任意一种；所述荧光抗体纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的任意一种；所述的吸水材料层的材料为吸水滤纸，所述的支撑层的材料为不吸水的韧性材料；所述的纤维素膜层的材料为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜中的任意一种。进一步的，所述检测线中的隐形检测印迹和质控线中的隐形对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹，或为“●●”点状排列印迹。进一步的，在所述吸附纤维层、荧光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与荧光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm。本专利技术还提供了上述的一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：1)一个制备大肠杆菌O157:H7单克隆抗体或多克隆抗体的步骤；2)一个制备荧光抗体的步骤；3)一个制备吸附纤维层的步骤，所述的吸附纤维层采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；4)一个制备荧光抗体纤维层的步骤，在所述的荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体；5)一个制备纤维素膜层的步骤，所述的纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上喷点检测印迹，烘干后备用；6)一个组装试纸的步骤，将吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。进一步的，所述的吸附纤维层的制备方法如下：将玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜浸入TBS缓冲溶液中，所述的缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.8，所述的缓冲溶液中，还含有PVP、蔗糖、Tw-20、BSA，在所述的缓冲溶液中，PVP的质量百分比浓度为0.5％，蔗糖的质量百分比浓度为1％，Tw-20的质量百分比浓度为0.5％，BSA的质量百分比浓度为1％，以浸湿为准，冻干，备用。本专利技术还提供了采用上述的夹心型免疫层析试纸检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：1)样品前增菌：将FITC溶于DMSO，在增菌培养基中加入FITC溶液，再加入样品进行增菌培养；2)试纸检测：将试纸插入样品溶液，10～20秒后拿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层的上侧面上设置有吸附层，所述的吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述的吸附纤维层和应该抗体纤维层紧密连接，所述的荧光抗体纤维层和所述的纤维素膜层紧密连接，所述的纤维素膜层和所述的吸水材料层紧密连接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，其特征在于：所述的检测线由抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述的质控线由羊抗或兔抗小鼠IgG抗体、或羊抗兔IgG抗体构成，所述荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，所述的荧光抗体由FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层的上侧面上设置有吸附层，所述的吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述的吸附纤维层和应该抗体纤维层紧密连接，所述的荧光抗体纤维层和所述的纤维素膜层紧密连接，所述的纤维素膜层和所述的吸水材料层紧密连接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，其特征在于：所述的检测线由抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述的质控线由羊抗或兔抗小鼠IgG抗体、或羊抗兔IgG抗体构成，所述荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，所述的荧光抗体由FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，其特征在于：所述的吸附层的上端设置有保护层。3.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，其特征在于：所述的FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法包括如下步骤，(1)一个配置交联反应液的步骤，在每升反应液中加入7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3和7.36g NaCl，余量为超纯水，将纯化后的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体于4℃对交联反应液中透析2～4次，至pH＝9.0；(2)将透析后的反应液转移至反应容器中，放于磁力搅拌器上，按照抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体：FITC的量为1mg:150μg的比例滴加FITC的DMSO溶液，避光，4℃反应过夜，加入5mol/L的NH4Cl 4℃至终浓度为5mmol/L，终止反应2h；(3)将交联物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮，4℃暗处保藏备用。4.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，其特征在于：所述的吸附纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的任意一种；所述荧光抗体纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的任意一种；所述的吸水材料层的材料为吸水滤纸，所述的支撑层的材料为不吸水的韧性材料；所述的纤维素膜层的材料为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜中的任意一种。5.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春美，刘箐，刘金鑫，李建武，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31