一种用镧系荧光配合物检测及加速β淀粉样蛋白聚集的方法技术

技术编号:13776558 阅读:81 留言:0更新日期:2016-10-01 00:06
本发明专利技术公开了一种用镧系荧光配合物检测及加速β淀粉样蛋白聚集的方法,属于医药技术领域。该方法利用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体,将咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物作为天线基团与铕(III)‑DTPA发光中心偶联制得荧光配合物Eu‑L,天线基团能够与具有β‑折叠构象的Aβ疏水区氨基酸残基选择性结合,氨基酸的光诱导电子转移阻碍了天线基团到铕(III)的能量传递,导致Eu‑L荧光降低,利用荧光变化检测Aβ聚集体。该方法还利用镧系荧光配合物加速Aβ聚集,基于天线配体与Aβ聚集体的高亲和性,Eu‑L能够加速将Aβ寡聚体转化成纤维体,并利用自身荧光同步监测Aβ聚集过程,在AD诊疗方面具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
,具体涉及一种用镧系荧光配合物检测及加速β淀粉样蛋白聚集的方法
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种严重危及中老年人身心健康的进行性认知减退的中枢神经系统退行性疾病。AD主要的病理特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积所形成的老年斑(SP)、异常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结(NFTs)以及大脑皮质和海马区神经元的丢失、变性或死亡,其中Aβ在各个特征病理形成过程中都发挥了重要作用,是AD发生发展过程中的肇始因素和中心环节。Aβ主要包含Aβ40和Aβ42,是淀粉样蛋白前体分别被β-和γ-分泌酶水解而产生的蛋白质片段,其聚集体,特别是寡聚体具有较强的神经毒性,可以引发脑神经细胞产生活性氧,导致氧化应激,并作用于钙离子通道,造成钙内流,使细胞凋亡,进一步造成海马和大脑皮层神经元变性与死亡,致使记忆功能障碍,最终引发AD。因此,Aβ聚集体通常被作为AD诊断与治疗的的生物标志物和药物靶标。基于此,大量的具有Aβ靶向性的有机小分子、金属配合物以及多肽类衍生物被设计合成并应用于AD的诊断和治疗。但是绝大多数化合物仍存在毒副作用大、安全窗窄、血脑屏障穿透性差等缺陷。更关键的是,由于它们多为单一功能的诊断或治疗药物,容易因延误治疗或治疗时机不佳造成无效药物治疗。镧系荧光配合物由于大的斯托克位移、长的荧光寿命以及发射峰形较窄的等光学优势在生物和医学检测方面具有广泛的应用。但是目前还没发现其用于检测与加速Aβ聚集并以此开发AD诊疗剂的应用。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术要解决的技术问题在于提供一种用镧系荧光配合物检测及加速Aβ聚集的方法。该方法不仅能够加速Aβ寡聚体聚集形成纤维体并降低聚集体神经毒性,还可以通过镧系荧光跟踪监测Aβ聚集过程,为AD诊疗剂的开发提供有益信息。为实现本专利技术目的,本专利技术将以DTPA为螯合基团的镧系发光中心与咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物偶联获得镧系荧光配合物,利用咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物与Aβ聚集体的高亲和性以及高的能量传递效率,选择性地与含β-折叠构象Aβ聚集体结合并使其加速转化成纤维体,同时镧系荧光配合物对β-折叠构象Aβ聚集体具有灵敏地荧光响应,利用荧光变化跟踪
监测Aβ聚集,从而不仅能降低Aβ聚集体毒性,还可以定性或定量监测Aβ聚集程度的变化。本专利技术首先提供一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,该方法包括:步骤一:合成镧系荧光配合物;步骤二:将Aβ样品加入到缓冲溶液中,在37℃分别孵育0、4和7天制备Aβ单体、寡聚体以及纤维体溶液;步骤三:在步骤二制得的溶液中分别加入Eu-L,利用时间分辨荧光检测方法检测Eu-L的荧光响应。优选的是,所述的镧系荧光配合物以二乙基三胺五乙酸(DTPA)偶联咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物作为配体,并以铕(III)作为镧系金属离子形成铕(III)荧光配合物Eu-L,结构式如附图1所示。铕(III)荧光具有荧光寿命长以及发光波长较长(红光)等优势。优选的是,所述的缓冲溶液为20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.4。优选的是,所述的时间分辨荧光检测参数设置为:延迟时间为50μs;检测时间为2.0ms;激发与发射狭缝宽度均为18nm;检测电压为950V。本专利技术还提供一种用镧系荧光配合物加速Aβ聚集的方法,该方法包括:步骤一:合成镧系荧光配合物;步骤二:将不同浓度的Eu-L分别与Aβ单体样品在缓冲溶液中37℃共同孵育7天加速Aβ聚集;步骤三:利用时间分辨荧光检测方法跟踪监测Aβ聚集加速。优选的是,所述的镧系荧光配合物以二乙基三胺五乙酸(DTPA)偶联咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物作为配体,并以铕(III)作为镧系金属离子形成铕(III)荧光配合物Eu-L,结构式如附图1所示。铕(III)荧光具有荧光寿命长以及发光波长较长(红光)等优势。优选的是,所述的缓冲溶液为20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.4。优选的是,所述的时间分辨荧光检测参数设置为:延迟时间为50μs;检测时间为2.0ms;激发与发射狭缝宽度均为18nm;检测电压为950V。与现有技术相比,本专利技术具有以下有益效果:本专利技术首先提供一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,该方法利用含有咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物的铕(III)荧光配合物Eu-L识别检测具有β-折叠构象的Aβ聚集体。咪唑并[1,2,a]吡啶基团能够与具有β-折叠构象的Aβ疏水区氨基酸残基通过氢键和π-π堆积作用选择性结合,它们之间的光诱导电子转移阻碍了咪唑并[1,2,a]吡啶基团到铕(III)金属中心的能量传递效率,最终造成了Eu-L荧光的淬灭。实验结果表明,Eu-L对含β-折叠构象的Aβ聚集体具有选择性荧光降低,并随聚集体浓度增大荧光降低越显著,能够利用荧光变化定
性或定量检测Aβ聚集体。考虑到时间分辨荧光的高信噪比,Eu-L具有较好的检测和诊断AD的潜力。本专利技术还提供一种用镧系荧光配合物加速Aβ聚集的方法,将Eu-L与Aβ单体共同孵化,通过比浊度和ThT荧光检测Aβ聚集程度,实验结果显示,Eu-L能够加速将Aβ寡聚体转化成纤维体,而且Eu-L浓度越大,加速效果越明显。利用透射电镜进行形貌观察可以发现,相比于Aβ自聚集,Eu-L存在下能清楚地观察到更多的Aβ纤维体。以上实验结果表明,Eu-L能够加速Aβ聚集形成纤维体。更为重要的是,Eu-L的荧光由于Aβ聚集程度的增加而出现了同步的降低。因此,本专利技术提供的镧系荧光配合物在检测与加速Aβ聚集方面具有很好的效果。本专利技术提供的镧系荧光配合物具有较好的AD诊疗应用前景。附图说明图1为实施例镧系荧光配合物Eu-L结构式;图2为实施例Eu-L与不同浓度Aβ40纤维体的时间分辨荧光光谱图;图3为实施例Eu-L对不同浓度的Aβ40单体、寡聚体以及纤维体荧光响应图;图4为实施例Aβ40纤维体存在下Eu-L的615nm处荧光强度随作用时间变化图;图5为实施例Eu-L对不同生物大分子(谷胱甘肽(GSH)、小牛胸腺DNA(CT-DNA)、Tau蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和Aβ40纤维体)的荧光响应选择性图;图6为实施例不同浓度Eu-L对Aβ40聚集的加速作用的比浊度(A405)检测图(A)和硫磺素T(ThT)荧光检测图(B);图7为实施例Eu-L对Aβ40聚集影响的透射电镜图;图8为实施例Eu-L荧光跟踪监测Aβ40加速聚集的比浊度(A405)和荧光强度(615nm)随孵育时间变化图。具体实施方式下面结合实施例及实施例中的附图对本专利技术进行更好的说明。实施例一:镧系荧光配合物检测Aβ聚集体:步骤一:合成优选镧系荧光配合物Eu-L,合成路线图如下所示。称取2-氨基吡啶(0.376g,4mmol)和α-溴代对硝基苯乙酮(0.486g,2mmol),溶于20mL乙腈溶液中,搅拌,80℃回流3h,血红色溶液中出现大量橘黄色沉淀,抽滤,用乙腈洗,收集沉淀,干燥得橘黄色固体(0.520g产率:90%)。1H NMR(CDCl3,500MHz,δ,ppm):6.90(t,1H,imidazo[1,2,a]pyridine),7.30(t,1H,imidazo[1,2,a]py本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,其特征在于,该方法包括:步骤一:合成镧系荧光配合物;步骤二:将Aβ样品加入到缓冲溶液中,在37℃分别孵育0、4和7天制备Aβ单体、寡聚体以及纤维体溶液;步骤三:在步骤二制得的溶液中分别加入Eu‑L,利用时间分辨荧光检测方法检测Eu‑L的荧光响应。

【技术特征摘要】
1.一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,其特征在于,该方法包括:步骤一:合成镧系荧光配合物;步骤二:将Aβ样品加入到缓冲溶液中,在37℃分别孵育0、4和7天制备Aβ单体、寡聚体以及纤维体溶液;步骤三:在步骤二制得的溶液中分别加入Eu-L,利用时间分辨荧光检测方法检测Eu-L的荧光响应。2.根据权利要求1所述的一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,其特征在于,所述的镧系荧光配合物以二乙基三胺五乙酸(DTPA)偶联咪唑并[1,2,a]吡啶衍生物作为配体,并以铕(III)作为镧系金属离子形成铕(III)荧光配合物Eu-L。3.根据权利要求1所述的一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,其特征在于,所述的缓冲溶液为20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.4。4.根据权利要求1所述的一种用镧系荧光配合物检测Aβ聚集体的方法,其特征在于,所述的时间分辨荧光检测参数设置为:延迟时间为50μs;检测时间为2.0ms;激发与发射狭缝宽度均为...

【专利技术属性】
技术研发人员:王小辉罗剑
申请(专利权)人:南京工业大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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