一种耐受有毒产物的细胞固定化方法及其固定化细胞生产1,5-戊二胺工艺技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐受有毒产物的细胞固定化方法及该固定化细胞转化生产1,5‑戊二胺的连续化生产工艺。本申请对聚乙烯醇与海藻酸钠配比及相应的成胶方法进行了研发优化，制备的固定化细胞具有可耐受高浓度1,5‑戊二胺对菌体细胞的损伤、有较好的膨胀性能、可耐受转化过程中大量二氧化碳气体的释放对结构的影响、机械强度高、使用寿命长等优点；并且分批使用6次以后活力保持在98%以上，连续使用12h后活力保持在70%以上。本发明专利技术所提供的连续化生产工艺所需设备少，便于操作，生产规模放大容易，自动化程度高。生产过程不添加任何中和剂；产品澄清，分离纯化容易。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，特别涉及耐受有毒产物的细胞固定化方法及其固定化细胞生产1,5-戊二胺工艺。
技术介绍
1,5-戊二胺(简称戊二胺)，即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在农业生产中，1,5-戊二胺可以作为植物生长调节剂，调节植物衰老过程，刺激植物生长，促进果实发育；此外，1,5-戊二胺还可以提高植物的耐冷性；在医药上，1,5-戊二胺是临床上用于治疗铁中毒药物去铁胺B的前体；而1,5-戊二胺目前最有价值的应用是作为尼龙单体与丁二酸、己二酸、癸二酸等聚合合成PA5.4、PA5.6、PA5.10等生物尼龙。近年来，由于生物尼龙的深入开发及应用，1,5-戊二胺的需求量不断增加。目前1,5-戊二胺的获取方法主要有提取法、化学法、发酵法及全细胞催化法。提取法来源有限，过程复杂，无法工业化生产；化学法以腈类为原料，产量高，适合大规模工业生产，但其反应过程剧烈，污染较大，不符合绿色发展的要求；发酵法原料来源广泛且可再生，成本低，污染也较小，但其调控过程比较复杂,产量也较低。全细胞催化法是指利用完整的生物细胞作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化，是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。相比发酵法，全细胞催化克服了发酵法生产周期长、代谢产物复杂、底物转化率低、产物分离提取困难及能耗高等缺点。相比纯酶催化反应，全细胞中各酶系维持原有状态和特定位置，酶稳定性更好，半衰期更长，适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生；细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，催化效率高。但由于高浓度的产物1,5-戊二胺对菌体细胞有明显的损伤，造成菌体随转化的进行而逐渐破碎。一方面，破碎的菌体细胞1,5-戊二胺生产效率显著下降，严重制约了1,5-戊二胺的产量；另一方面，菌体细胞无法重复使用，因而需重复培养以获取大量的菌体细胞，从而造成生产成本的增加。此外，每批次的菌体活力也会有差异，导致每批次产出的1,5-戊二胺含量差异，从而影响后续分离纯化操作。因而，开发一种可长时间维持菌体活力的方法具有重要的意义。固定化细胞技术是一种常用的保护细胞的方法，在保持细胞活力具有一定的作用。此外，固定化的细胞可以反复使用，降低了生产成本。在细胞固定化方法中，包埋法因其操作简便、易于放大和通用性等原因应用最广。适用于包埋法的载体种类较多，如海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、琼脂糖等，其中应用最为广泛的是聚乙烯醇和海藻酸钠，由于单独使用聚乙烯醇制备的凝胶球容易粘连，因而通常将二者按一定比例混合使用。但二者的配比和相应的成胶方法对固定化细胞的活性和固定化小球的机械强度影响较大，特别是在类似L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺的脱羧反应过程中，大量的二氧化碳释放对固定化小球的机械强度影响更为显著，现有方法无法满足工业化生产的需求。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服1,5-戊二胺生产过程中由于高浓度产物1,5-戊二胺的细胞毒性造成的菌体裂解和生产能力下降。本专利技术首先提供了一种细胞的固定化方法，该方法不仅可以有效的保护细胞以耐受高浓度的有毒产物，还可以耐受转化过程中释放气体对固定化球体机械强度的影响。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种耐受有毒产物的细胞固定化方法，包括如下步骤：(1)冷水加入聚乙烯醇后加热至98℃溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷却至40-50℃，加入含有细胞保护剂的菌悬液，充分搅拌均匀；(2)用注射器或蠕动泵将步骤(1)所述混合液滴加到交联剂溶液中，形成直径0.3-0.5cm的小球，室温静置6-12h后，-45～-80℃冷冻8-16h；冷冻结束后，室温缓慢融化，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。优选的，所述的细胞保护剂为甘油，甜菜碱，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甘露醇中的任一种；优选PVP或甜菜碱。优选的，按质量比计，海藻酸钠：聚乙烯醇：菌体细胞(湿重)：细胞保护剂为0.5～6.5：2～10：1～5：1～10优选的，所述的菌体为3％(按质量百分比)。优选的，所述的交联剂为(按质量百分比)0.5～6.5％的氯化钙溶液。本专利技术还提供了一种由上述权利要求1-4任一方法获得的固定化细胞。本专利技术也提供了一种所述的固定化细胞连续生产1,5-戊二胺的工艺，其特征在于，包括如下步骤：(1)将所述的固定化细胞装入柱式反应器中，填充细胞的径高比为1：5～1：10。(2)以4～10g(L-赖氨酸)/g(细胞湿重)/h的流速将L-赖氨酸溶液泵入到步骤(1)的固定化细胞柱反应器中。其中，柱反应器可以多组串联或并联组合使用。本专利技术的有益效果主要体现在：(1)本专利技术所提供的固定化方法具有材料成本低，操作简单，重现性好等特点。(2)制备的固定化细胞具有如下显著优点：①可耐受高浓度1,5-戊二胺对菌体细胞的损伤。②有较好的膨胀性能，可耐受转化过程中大量二氧化碳气体的释放对结构的影响。③机械强度高，可耐受发酵罐在500rpm下连续搅拌12h不破碎，可耐压0.2～0.4MPa。④使用寿命长。分批使用6次以后活力保持在98％以上，连续使用12h后活力保持在70％以上。(3)本专利技术所提供的连续化生产工艺所需设备少，便于操作，生产规模放大容易，自动化程度高。生产过程不添加任何中和剂；产品澄清，分离纯化容易。因此本专利技术也可以广泛应用于反应过程中因毒性产物而产生破坏菌体活力的生物转化生产，也可应用于其他反应过程中有气体产生的固定化细胞的制备。附图说明图1为聚乙烯醇(PVA)成胶方法对菌体活力的影响。图2为菌体量与固定化菌体活力的关系。图3为响应面法(CCD设计)试验结果验证。图4为细胞保护剂添加试验。图5为固定化细胞重复使用试验。图6为固定化细胞柱反应器连续生产1,5-戊二胺。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1使用不同浓度的PVA与2％海藻酸钠的混合物作为固定材料，分别使用硼酸交联法和冷冻法制备固定化细胞。具体操作方法为：冷水加入聚乙烯醇后加热至98℃溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷却至40-50℃，加入菌悬液至终浓度为10g(湿菌重)/L，充分搅拌均匀。用注射器或蠕动泵将上述混合液滴加到交联剂溶液中得到直径0.3～0.5cm的小球。硼酸交联法交联剂使用含3％(质量百分比)氯化钙的饱和硼酸溶液；冷冻法交联剂为3％(质量百分比)的氯化钙溶液。对于硼酸交联法制得的小球，室温静置8h后，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。对于冷冻法制得的小球，先室温静置8h后，-80℃冷冻8h。冷冻结束后，室温缓慢融化，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。使用上述固定化细胞以L-赖氨酸盐酸盐为底物进行转化试验。转化体系包括：菌体细胞0.1g(湿菌重)，L-赖氨酸量150g/l。转化条件为37℃，200rp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐受有毒产物的细胞固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）冷水加入聚乙烯醇后加热至98℃溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷却至40‑50℃，加入含有细胞保护剂的菌悬液，充分搅拌均匀;（2）用注射器或蠕动泵将步骤（1）所述混合液滴加到交联剂溶液中，形成直径0.3‑0.5 cm的小球，室温静置6‑12 h后，‑45 ~ ‑80℃冷冻8‑16 h;冷冻结束后，室温缓慢融化，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。

【技术特征摘要】
1.一种耐受有毒产物的细胞固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）冷水加入聚乙烯醇后加热至98℃溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷却至40-50℃，加入含有细胞保护剂的菌悬液，充分搅拌均匀;（2）用注射器或蠕动泵将步骤（1）所述混合液滴加到交联剂溶液中，形成直径0.3-0.5 cm的小球，室温静置6-12 h后，-45 ~ -80℃冷冻8-16 h;冷冻结束后，室温缓慢融化，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。2.根据权利要求1所述的细胞固定化方法，其特征在于，所述的细胞保护剂为甘油，甜菜碱，二甲基亚砜（DMSO），聚乙烯吡咯烷酮（PVP），甘露醇中的任一种；优选PVP或甜菜碱。3.根据权利要求1所述的细胞固定化方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，马伟超，沈金山，曹逊，何育美，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32