研磨方法技术

提供了用于处理作物籽粒的方法，这些方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。专利
本专利技术涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本专利技术还涉及一种酶组合物并且涉及本专利技术的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本专利技术的方法的酶活性。专利技术背景作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小时，以开始使淀粉和蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨，以破坏果皮并使胚芽与剩余的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成，将其细磨并筛选，以将纤维与淀粉和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆或醇，或干燥并销售为玉米淀粉，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种改性湿磨方法，该方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。参见约翰斯顿(Johnston)等人，谷物化学(Cereal Chem)，81，第626-632页(2004)。US 6,566,125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉
及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并用酶(例如，蛋白酶)孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。US 5,066,218披露了一种研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洗谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。WO 2002/000731披露了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。WO 2002/000911披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。WO 2002/002644披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。专利技术概述本专利技术涉及一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或
SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。在一个优选实施例中，具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、或来自污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)或变色栓菌(Trametes vericolor)的S53蛋白酶。在一个优选实施例中，该蛋白酶包括以下各项或由其组成：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。在一个优选实施例中，该蛋白酶包括以下各项或由其组成：披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。本专利技术还涉及在处理作物籽粒的方法中使用的多肽的用途以及包括在本专利技术中使用的多肽的酶组合物。序列表综述SEQ ID NO:1是如分离自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的cDNA序列。SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是具有HQ标记的重组表达DNA序列的DNA序列。SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是来自大型亚灰树花菌的成熟S53蛋白酶3的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是从SEQ ID NO:3获得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是引物597。SEQ ID NO:8是引物598定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞获得的。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码；(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.26 CN PCT/CN2013/0878611.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码；(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽是一种与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多肽。3.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性。4.如权利要求1所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5
\t或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、来自污叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白酶。6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属、叉丝孔菌属、或栓菌属，优选来自大型亚灰树花菌、污叉丝孔菌或变色栓菌。7.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在β-木糖苷酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。8.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素酶和/或半纤维素酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。9.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在木聚糖酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。10.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素分解组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该纤维素分解组合物包括：1)纤维素酶或半纤维素酶，和2)GH61多肽。11.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在乙酰木聚糖酯酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。12.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在一种选自下组的酶的存在下处理这些浸泡的籽粒，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61多肽、或其组合。13.如以上权利要求中任一项的方法，其中所述多肽按以下量存在：优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.001至1mg酶蛋白/...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙祯，徐望晖，韩望，S·R·麦克劳克林，R·戴因哈默，P·桑德斯，B·小维达尔，沈心妤，M·J·阿克曼，T·吉本斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK