本发明专利技术涉及一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。该方法是将辣椒疫霉接种V8培养基上，用封口膜密封25℃恒温培养5d后去掉封口膜照光24h后加入无菌水4℃诱导和常温释放各25min获得游动孢子悬浮液，稀释至每个(10×)视野中1‑2个，取1mL加入带有抗生素的V8培养基平板中涂均匀，常温放置6h，通过倒置显微镜寻找单个萌发的游动孢子，用手术刀切0.5cm的正方形印痕，确认单孢后转移至抗生素平板中，纯化即为单孢株。本发明专利技术操作简便、准确性高、快速、分离效果好、设备简单，可短时间内大批量分离辣椒疫霉游动孢子的单孢子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农业植物保护
，具体涉及一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。
技术介绍
辣椒疫病(Phytophthora blight)是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici L.)引起的一种毁灭性病害，除危害辣椒的根、茎、枝、叶和果实外，还危害番茄、茄子、黄瓜、甜瓜等作物，常引起大面积死株，一般田块死株率为20％-30％，严重的达90％以上，辣椒疫病对产量、品质影响极大，严重时减产50％以上，甚至造成毁灭性的危害。辣椒抗病育种是防治辣椒疫病的最直接、最有效的途径。开展了大规模的辣椒抗疫霉种质资源的筛选是抗病育种的前提，而抗源筛选的前提是得到大量的且有代表性的单孢株。目前，辣椒疫霉游动孢子单孢株分离的方法基本是参考袁军海和姚裕琪(2002)对马铃薯晚疫病菌游动孢子单孢子的分离方法：制备游动孢子囊或游动孢子悬浮液，待游动孢子萌发产生芽管后在显微镜下进行，在载物台上将盖玻片消毒后置于消毒过载玻片上，取10-15μL孢子悬浮液，在盖玻片上滴一滴，然后镜检，确认这滴悬浮液中只有1个游动孢子囊或游动孢子，即为单孢株，该方法过程复杂，不容易找到单孢株，容易感染杂菌；朱桂宁等(2003)采用稀释法对致病疫霉游动孢子单孢子进行分离，主要是稀释致一定浓度，涂抹到黑麦和燕麦基础培养基上，一定时间后查看单菌落，确认单孢株，该方法也可能分离到菌丝形成的菌落，且一旦菌落形成不容易确定是否为单孢子形成的菌落；辣椒疫霉单孢子囊分离的方法基本采用柴贵贤等(2010)，主要是针对辣椒疫霉游动孢子囊的单囊分离。上述的研究报道的方法存在工作量大、准确性不足、耗费时间长、过程繁锁等问题。针对辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离、其个体小、颜色浅、在视野中无规则运动、其分离难度大，本专利技术可操作性强、准确性高、速度快、分离效果好，设备简单。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离方法。为达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案得以实现。(1)V8汁琼脂培养基的制备：将V8汁(100％蔬菜)(金宝V8，美国进口，超市有售)用离心机4,000rpm离心去掉沉淀，配制10％的V8汁琼脂培养基，湿热灭菌20min；(2)辣椒疫霉游动孢子囊的产生：将辣椒疫霉接种步骤(1)中制备的V8汁琼脂培养基平板中，用封口膜(型号PM-996,美国Parafilm)密封，25℃黑暗培养5d促使菌丝生长，然后去掉封口膜，转移至光下(5 000lx)23-25℃培养24h，促进游动孢子囊的产生；(3)辣椒疫霉游动孢子悬浮液的配制：将步骤(2)产生大量的游动孢子囊的平板加入15mL无菌水置于4℃冰箱中25min后，置于室温(23-25℃)25min，倒出悬浮液(即辣椒疫霉游动孢子悬浮液)，用无菌水稀释至平均在显微镜下每个(10×)视野中只有1-2个游动孢子的悬浮液；(4)辣椒疫霉游动孢子平板的制备：取步骤(3)中1mL孢子悬浮液平铺于带有V8汁琼脂培养基的平板上，放置室温(23-25℃)6h，促进游动孢子萌发；(5)辣椒疫霉游动孢子单孢株的分离：将倒置显微镜放在无菌操作台上，30min紫外灭菌后，将步骤(4)带有游动孢子的平板倒掉残余的悬浮液，放在载物台上在(10×)视野中查找只有1个萌发的游动孢子，然后将手术刀在火焰上灭菌冷却后，在单个游动孢子周围(倒置显微镜镜头正上方)培养基上切个长0.5cm的正方形切痕，再一次确认切痕中只有1个游动孢子；(6)辣椒疫霉游动孢子单孢株的挑取及纯化：用手术刀取出步骤(5)确认为带有单个游动孢子的培养基小块后，放入另一个带有青霉素(50μg/mL)的V8培养基平板中，然后放入恒温箱中25℃黑暗培养2d，挑取边缘的菌丝纯化到试管中，即得到辣椒疫霉游动孢子单孢株。本专利技术的显著优点：本专利技术是针对辣椒疫霉游动孢子小，无色，在视野中无规则游动难捕捉、不容易分离，提供了一种辣椒疫霉游动单孢株分离的方法。辣椒疫霉孢子囊的产生传统方法有专利技术专利公开号为CN102391980A和CN102391980A是诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法，这两个专利获得游动孢子需要时间长，刷洗游动孢子或是用无菌型玻棒涂抹长满菌丝的培养基平板，将会带有较多菌丝在里面，无法过滤出去，获得单游动孢子的机率降低，而本专利在游动孢子释放过程中，对菌丝是没有任何扰动的，游动孢子悬浮液中是没有菌丝的，更适合游动孢子单孢子分离的。专利公开号为CN102154193A也诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法，但产生的孢子囊不能达到无菌条件，不能用于游动孢子单孢株的分离。本专利技术与其它单孢分离方法相比，可操作性强、准确性高、速度快、分离效果好、设备简单，可以短时间在实验室内进行大批量辣椒疫霉游动孢子的单孢株分离。具体实施方式以下结合实施例和试验数据，对本专利技术上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。辣椒疫霉游动孢子的单孢株分离具体操作本实施例用辣椒疫霉(可自行分离培养，也可以相关报道中获得：司美茹，薛泉宏，余博，袁虎林，陈占全.辣椒疫霉生防菌的双重筛选.植物保护学报,2006,33(1):41-46；陈孝仁，李艳朋，邢玉平，徐敬友，童蕴慧.辣椒疫霉CRN编码基因的克隆、转录特征及在与寄主互作中的作用.植物病理学报,2015,45(4):384-394)；金宝V8(100％蔬菜)汁为美国进口，中国各大超市均有售；封口膜(型号PM-996,美国Parafilm)在试剂公司有售，具体操作如下：(1)辣椒疫霉游动孢子母液的获得将要分离的辣椒疫霉接种到V8(100％蔬菜)汁培养基平板上，用封口膜密封，25℃黑暗培养5d促使菌丝生长，然后去掉封口膜，转移至光下(5 000lx)23℃培养24h促进游动孢子囊的产生。在平板中加入15mL无菌水置于4℃冰箱中25min后，置于室温(23-25℃)20-30min，倒出悬浮液(即辣椒疫霉游动孢子悬浮液)。(2)分生孢子的萌发和稀释用无菌水稀释至显微镜每个(10×)视野中仅含有1-2个游动孢子的悬浮液，取1mL孢子悬浮液平铺于带有V8汁培养基的平板上，室温(23-25℃)放置6h，倒掉残余的悬浮液。(3)分生孢子的单孢分离将其放置在倒置显微镜上，在每个(10×)视野中观察只有1个萌发的游动孢子，用手术刀在火焰上灭菌冷却后，在游动孢子周围(即倒置显微镜镜头上方)用刀切成长为0.5cm的正方形小块，再一次确认其中只有1个萌发的孢子。用手术刀取出确认为带有单个游动孢子的培养基小块后，放入另一个带有青霉素(50μg/mL)的V8培养基平板中，然后放入恒温箱中25℃黑暗培养3d，挑取边缘的菌丝纯化到试管中，即得到辣椒疫霉游动孢子单孢株。实施例1、辣椒疫霉单孢株的交配型的测定本实施例所用的辣椒疫霉对照菌株A1交配型(付迎坤,田晓丽,李屹,李莉.青海省辣椒疫霉菌交配型分析及分布特征.北方园艺,2014(18):实验方法如下：(1)辣椒疫霉的分离在辣椒种植的地块采集辣椒疫霉病株，取病健交界处组织若干块，经70％酒精处理1-2s，然后放置到0.1％的升汞中处理3min，无菌水换洗3次，干燥后放入带有
青霉素(50μg/mL)的V8汁琼脂培养基平板上，26℃黑暗培养2-3d，待长出菌落，纯化备用。(2)游动孢子单孢子分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。
【技术特征摘要】
1.一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法是将V8汁用离心机4000rpm离心去掉沉淀，配制10％的V8汁琼脂培养基，湿热灭菌后备用。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法是将辣椒疫霉接种到V8汁琼脂培养基平板上，用封口膜密封，25℃黑暗培养5d促使菌丝生长，然后去掉封口膜转移至荧光灯下(5 000 lx)23-25℃培养24h促进游动孢子囊的产生。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法是将产生大量的游动孢子囊的平板加入15mL无菌水置于4℃冰箱中25min后，置于室温(23-25℃)25min，倒出悬浮液，即为辣椒疫霉游动孢子悬浮液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中用无菌水稀释至平均每个(10×)视野中只有1个游动孢子的悬浮液，将取1mL孢子悬浮液平铺于带有V8汁培养基的平板上，室温(23-25℃)放置6h。6.根据权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永刚，陈雅君，张铉哲，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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