本发明专利技术公开了一种以效应为导向复杂环境样品中目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：样品前处理及初步分离；雄激素活性测试；致毒物质的高通量分离与制备；基于高效液相色谱–飞行时间质谱的活性组分扫描；雄激素干扰物目标性筛选；结合质谱、色谱和毒性特征的雄激素干扰物非目标性鉴别与毒物确认。本发明专利技术利用SPE柱和制备分离相串联的方法进行分离，将DMSO作保护剂优化高通量分离浓缩方法，利用目标数据库实现关键毒物目标性鉴别，基于高效液相色谱–飞行时间质谱谱库进行质谱特征鉴别、基于保留时间与化合物物化性质进行色谱特征鉴别、基于分子动力学模拟技术进行毒性特征鉴别，进而实现关键雄激素干扰物的非目标性识别与毒物确认。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以效应为导向的关键雄激素干扰物质的鉴别方法，更具体地说，涉及一种基于报告基因实验的毒性测试和复合污染环境样品分级分离的雄激素干扰物筛选、定性识别和定量确认的方法。
技术介绍
随着社会经济的不断发展，在工农业生产及日常生活中，越来越多的化学物质被释放到环境中。由于污染物种类繁多，成分复杂，环境污染往往是由多种污染物相互作用共同引发的，因此依赖传统单一的化学分析方法逐个鉴别复合污染环境样品中的污染物难度大，并会消耗大量的时间和人力，很难进行完善的环境风险评价。而以毒性效应为导向的化学分析方法(Effect-directed Analysis,EDA)则将毒性效应和化学分析结合起来，可有效鉴别复合污染环境样品中的关键致毒物质。内分泌干扰物是能对人类或野生动物的内分泌干扰系统产生影响的激素或化合物。它们通过摄入、积累等各种途径，类似于激素对生物体起作用，即使数量极少，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常现象，因此环境样品中内分泌干扰物质的风险值得广泛关注。目前对于内分泌干扰物质的研究就主要集中在拟/抗雌激素活性物质，而对于雄激素活性的研究相对来说较为匮乏。雄激素活性物质可以在较低浓度下干扰生物正常内分泌调节过程，对发育和生殖功能产生不良影响，因而备受关注。目前也有很多研究表明雄激素在环境样品中尤其是在欧美地区是广泛检出的。但是环境样品中污染物种类繁多，中间产物及副产物也很复杂，因此如何在有效应检出的复杂环境样品中鉴别出主要的致毒物质是极其重要的。通过检索发现目前国内外文献还没有以效应为导向的基于制备色谱及凝胶排阻色谱分离以及高分辨质谱分析鉴别主要雄激素干扰物的报道，本方法以拟、抗雄激素活性效应为导向，利用固相萃取与制备色谱或凝胶排阻色谱相串联，结合保护液实现高通量分级分离，以目标性与非目标性相结合实现高分辨质谱分析，进而鉴别复合环境样品中雄激素干扰物质。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题针对人们日益关注的复合污染的环境样品中关键内分泌干扰物质的提取、分离和筛选鉴别的问题，本专利技术提供了一种以雄激素活性效应为导向的复合污染环境样品中主要雄激素干
扰物的鉴别方法，本专利技术包括环境样品的提取、高通量分离与制备、目标性和非目标性相结合的高分辨质谱的定性识别、筛选与确认，从而鉴别复合污染环境样品中的关键雄激素干扰物质，为复合污染环境的风险评价提供了科学依据。2.技术方案为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：(1)样品的提取：固态样品(如土壤、沉积物、灰尘及大气颗粒物等)干燥研磨过筛后利用加速溶剂萃取装置Dionex ASE350加速溶剂萃取仪来提取其中的有机物质，提取过程中先用二氯甲烷：正己烷＝1：1(体积比)的混合溶剂提取3轮并收集，再用纯甲醇溶剂提取3轮并分开收集；液态样品(如地表水和地下水等)经离心或过膜后利用HLB小柱富集液态样品中不同极性的污染物。(2)固相萃取：固相萃取柱预先分别用10mL的正己烷、10mL的二氯甲烷和10mL的甲醇进行活化后，将加速溶剂萃取的提取液通过氨基柱与HLB小柱串联进行富集和净化，流速控制在1-2滴/秒。(3)洗脱浓缩：氨基柱利用乙腈：甲苯＝3：1(体积比)洗脱；HLB小柱依次用10mL的甲醇：二氯甲烷＝1：1(体积比)的混合溶剂，10mL的二氯甲烷：正己烷＝4：1(体积比)的混合溶剂以及10mL的正己烷将物质从固相萃取柱上洗脱下来并收集，根据洗脱液的不同，有机提取物被分离成不同的初级组分，洗脱液经旋蒸、氮吹浓缩后定容于进样小瓶中。(4)MDA-Kb2(人体乳腺癌细胞)细胞报告基因测试：取部分初级组分浓缩液替换溶剂为二甲基亚砜DMSO后，配制成7个不同的梯度，每组设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测样品的拟、抗雄激素活性。(5)高通量分离与制备：可利用制备色谱或凝胶排阻色谱进行制备分离。利用制备色谱分离技术将有效应的初级组分基于物质极性及流出时间进行高通量分离制备，其参数如下：制备色谱仪：沃特世制备纯化色谱仪(Waters AutoPurification HPLC)；色谱柱：沃特世制备柱Waters XBridge C18制备柱，制备柱尺寸为19mm×150mm，粒径为5μm，流速：5mL/min；流动相：甲醇，水；收集方式：用15mL的玻璃管根据时间段进行收集。流动相梯度：利用凝胶排阻色谱将有效应的初级组分基于物质分子流体力学体积大小进行分离制备，其参数如下：凝胶排阻色谱仪：J2Scientific,AccuPrep MPS；色谱柱填料：Bio-Beads S-X3；内径：3cm；长度：20cm；淋洗液：环己烷和乙酸乙酯(V：V＝1：1)；流速：5mL/min。用15mL的玻璃管根据时间段进行收集。(6)分级分离的浓缩方法：对于制备色谱分离的组分最初采用直接氮吹的方式进行浓缩，但由于水和甲醇的混合体系不易浓缩，长时间氮吹导致整体回收率不足20％。本专利技术在浓缩过程中加入占最终定容体积20％的DMSO作为保护剂，有效提高了浓缩过程中的回收率。加入保护剂后次级组分中标准物质PAHs的回收率如图1所示。具体浓缩方式如下：(7)分离次级组分的MDA-Kb2细胞报告基因测试：取部分分离次级组分的浓缩液，稀释成7个梯度，每组设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测次级组分的拟、抗雄激素活性。通过与标准抗雄激素物质氟他胺进行比对，利用Graphpad软件拟合，计算组分的EC50/IC20，从而计算出各组分的毒性当量TEQ。(8)组分中化合物的定性识别：将有效应的次级组分通过高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF)进行分析，得到精准的相对分子质量和二级质谱图，并通过与仪器本身的数据库及网络数据库Chemspider进行比对，得到可疑化合物清单。所述步骤(8)中仪器的参数条件如下：高效液相色谱仪HPLC：安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1260)；色谱柱：安捷伦色谱柱(Agilent C18柱，尺寸为2.1mm×150mm，粒径为2.5μm；)；柱温：30℃；流动相：乙腈，体积百分比为5％的乙腈水溶液；流速：300μL/min；流动相梯度：质谱仪：Triple TOF 5600–AB ACIEX；离子源：ESI；电离模式：正离子模式和负离子模式；MS扫描范围：100-2000m/z；MSMS扫描范围：60-1250m/z；去簇电压：±80V；碰撞电压：±35±15eV。(9)组分中可疑雄激素活性物质的目标性筛选：根据已有文献报道的21种拟雄激素活性物质和124种抗雄激素活性物质的数据库，建立包含化学品名称、CAS号、EC20、EC50、特征离子和LogKow等信息的典型拟、抗雄激素活性物质特征离子数据库(详见授权专利《水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法》，专利号：CN201310539205.2)。并同时基于采样点周围环境建立采样点中可能含有物质的可疑物质物化信息数据库。利用质谱谱图数据分析软件PeakView，通过XIC Manager导入目标性物质数据库典型拟、抗雄激素活性物质特征离子对数据库，通过设置峰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：(1)样品的提取：固态样品干燥研磨过筛后利用加速溶剂萃取来提取其中的有机物质；液态样品经离心或过膜后利用固相萃取小柱实现不同极性污染物的同时富集；(2)初步分离：基于固相萃取小柱，利用不同极性有机溶剂洗脱来进行初步分离；(3)雄激素活性测试：基于稳定转染的MDA‑Kb2细胞系，测试拟、抗雄激素活性；(4)高通量分离与制备：针对活性效应组分，基于物质极性利用制备色谱进行分级分离，或基于物质分子量大小利用凝胶排阻色谱分离，添加保护液后氮吹，制备获得次级组分；(5)次级组分活性测试：针对步骤(4)所得组分，利用MDA‑Kb2细胞系测试组分的拟、抗雄激素活性；(6)活性次级组分中关键毒物定性识别：基于高效液相色谱‑飞行时间质谱，进行扫描分析，得到一级及二级质谱；(7)关键毒物目标性筛选：建立可疑雄激素活性物质数据库，导入目标毒物数据库，对目标物进行精确质量数计算和碎片分析，利用软件计算可能的碎裂方式及离子，比对一级和二级质谱来进行目标物质的筛选；(8)活性组分的非目标物质筛选：结合获得的色谱特征、质谱特征和毒性特征筛选非目标性活性物质；(9)毒物确认：购买标准品进行定量分析并测定EC50，计算毒物的毒性贡献率，将毒物按照定量分析的浓度配置到原空白介质中并进行毒物提取与毒性确认。...
【技术特征摘要】
1.一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：(1)样品的提取：固态样品干燥研磨过筛后利用加速溶剂萃取来提取其中的有机物质；液态样品经离心或过膜后利用固相萃取小柱实现不同极性污染物的同时富集；(2)初步分离：基于固相萃取小柱，利用不同极性有机溶剂洗脱来进行初步分离；(3)雄激素活性测试：基于稳定转染的MDA-Kb2细胞系，测试拟、抗雄激素活性；(4)高通量分离与制备：针对活性效应组分，基于物质极性利用制备色谱进行分级分离，或基于物质分子量大小利用凝胶排阻色谱分离，添加保护液后氮吹，制备获得次级组分；(5)次级组分活性测试：针对步骤(4)所得组分，利用MDA-Kb2细胞系测试组分的拟、抗雄激素活性；(6)活性次级组分中关键毒物定性识别：基于高效液相色谱-飞行时间质谱，进行扫描分析，得到一级及二级质谱；(7)关键毒物目标性筛选：建立可疑雄激素活性物质数据库，导入目标毒物数据库，对目标物进行精确质量数计算和碎片分析，利用软件计算可能的碎裂方式及离子，比对一级和二级质谱来进行目标物质的筛选；(8)活性组分的非目标物质筛选：结合获得的色谱特征、质谱特征和毒性特征筛选非目标性活性物质；(9)毒物确认：购买标准品进行定量分析并测定EC50，计算毒物的毒性贡献率，将毒物按照定量分析的浓度配置到原空白介质中并进行毒物提取与毒性确认。2.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(1)固态样品通过加速溶剂萃取的过程中使用的有机溶剂分别为二氯甲烷和正己烷的混合溶剂以及纯甲醇溶剂，二氯甲烷和正己烷的体积比为1:1，采用串联萃取两次并分别收集的方法；液态样品利用基于HLB小柱的固相萃取来实现不同极性污染物的同时富集。3.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(2)中固态样品富集液利用氨基柱与HLB小柱串联进行分离，液态样品利用HLB小柱直接分离；其中，氨基柱利用体积比为3：1的乙腈、甲苯混合溶剂洗脱，HLB小柱依次利用10mL体积比为1:1的甲醇、二氯甲烷混合溶剂，10mL体积比为4:1的二氯甲烷、正己烷混合溶剂，以及10mL正己烷溶剂洗脱。4.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(4)所述高通量分离与制备的参数设置如下：凝胶渗透色谱：J2Scientific，AccuPrep MPS；色谱柱填料：Bio-Beads S-X3；内径：3cm；
\t长度：20cm；淋洗液：体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯；流速：5mL/min；制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：史薇，郭婧，于红霞，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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