一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，该方法包括在低压环境中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌，灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养；所述的低压环境是指压力为40～60kP。通过低压和高温结合处理的方式，提高千层塔外植体表面的灭菌效率；同时，提高了千层塔外植体的存活率。本发明专利技术操作简单，在不影响千层塔后期培养的前提下，提高对其的灭菌效率，可用于千层塔的组织培养。

【技术实现步骤摘要】
一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及种一种提高千层塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)外植体表面灭菌效率的方法。
技术介绍
千层塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(LycopodiumL.)多年生草本蕨类植物。千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimerdisease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。但是，千层塔自然资源严重短缺。千层塔生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了千层塔野生资源的再生。千层塔中的石杉碱甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉碱甲步骤繁琐、价格昂贵且有副作用。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制。因此，不论是石杉碱甲直接或者间接获得都是以千层塔的原植物为原料，这种自然界有限的资源将处于灭绝的边缘。利用植物组织培养可进行珍稀和濒危药用植物的微繁殖，建立高效和稳定培养系，培育出脱毒的优质品种，解决珍稀濒危药用植物人工种植存在的种子稀少、种苗奇缺、种质退化等严重问题，为千层塔的资源再生和可持续利用提供技术手段。但是，千层塔组织培养过程主要采用的是叶片、茎和根。这些外植体存在外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低，而且灭菌后大部分死亡，不能生长、分化和增殖等问题。因此，对于千层塔的组织培养，外植体的灭菌至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，该方法能够显著千层塔外植体表面的灭菌效率，同时提高了千层塔外植体的存活率。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，该方法包括在低压环境中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌，灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养。具体的，所述的低压环境是指压力为40～60KP。更具体的，所述的千层塔外植体指千层塔的根、千层塔的茎或千层塔的叶。进一步的，千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌包括：取千层塔外植体依次经流水冲洗、体积分数为75％的乙醇溶液浸泡、体积分数为5％的NaOCl溶液浸泡及体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，千层塔外植体经NaOCl溶液和过氧化氢溶液浸泡时处于低压环境。具体的，千层塔外植体在NaOCl溶液中浸泡的低压环境时间为5～15min，千层塔外植体在过氧化氢溶液中浸泡的低压环境时间为5～10min。另外，将经过灭菌剂灭菌处理的千层塔外植体转接到MS固体培养基上于低压环境中培养，2周后取出千层塔外植体转移到常压培养室继续培养。还有，低压环境中培养的光照强度为2000Lux，低压环境中培养的光周期为16h；在常压培养室中的培养的温度为25℃。进一步的，在所述的MS固体培养基中添加100～200mg/L的两性霉素B。优选的，所述的低压环境中培养的培养温度为30～40℃。本专利技术的优点为：(1)本专利技术通过低压结合温和的灭菌剂处理，以及灭菌后的低压和高温培养，不仅提高了千层塔外植体的灭菌效率，同时还提高了千层塔的移栽成活率，可用于千层塔的组织培养，为千层塔的灭菌培养提供了新思路；(2)对千层塔外植体灭菌，最好的方案是：灭菌时，5％NaOCl浸泡时间为10分钟，7％过氧化氢浸泡时间为8分钟，两种灭菌剂浸泡时的压力为50KP；灭菌后前两周培养时，MS固体培养基中含有的两性霉素B的浓度为150mg/L，培养的压力为50KP，培养的温度为35℃。两周后进行正常的培养。在这样的条件下，千层塔的叶片除菌率和存活率分别达到60％和75％；千层塔的茎除菌率和存活率达到55％和78％；千层塔的根除菌率和存活率分别达到55％和58％。具体实施方式千层塔在人工组织培养中遇到的最大的问题就是外植体污染严重。如果灭菌时间不够，则灭菌效率极低；如果灭菌时间过长，则外植体成活率极低。严重阻碍了千层塔组织培养的成功。本专利技术的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，通过低压结合温和的灭菌剂处理，以及灭菌后的低压和高温培养，不仅提高了千层塔外植体的灭菌效率。此方法可用于千层塔的组织培养。一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，按以下步骤操作：步骤一，千层塔外植体的灭菌：取千层塔外植体(根或者茎，或者叶片)，用流水冲洗干净，用体积分数75％乙醇溶液浸泡1分钟，倒掉乙醇，然后用体积分数5％NaOCl溶液浸泡并立即放置到40～60kP的压力容器中，5～15分钟后取出，倒掉NaOCl溶液，换用体积分数7％过氧化氢溶液浸泡，立即放置到压力容器的低压环境中。放置5～10分钟后取出，倒掉过氧化氢溶液，用无菌水冲洗干净；步骤二，千层塔外植体的培养：将灭过菌的千层塔外植体转接到含有100～200mg/L两性霉素B的MS固体培养基上，并放置到40～60KP的压力容器中培养，培养温度为30～40℃，2周后取出，转移到培养室培养。在压力容器中和在培养室中的光照条件为：光照强度为2000Lux，光周期16小时。在培养室中的培养温度为25℃。2周后统计外植体的除菌率和存活率。MS培养基组成：1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO47H2O、0.44g/L的CaCl22H2O、0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO44H2O、8.6mg/L的ZnSO47H2O、0.25mg/L的Na2MoO42H2O、0.025mg/L的CuCl25H2O、0.025mg/L的CoCl26H2O、37.3mg/L的Na2EDTA、27.8mg/L的FeSO47H2O。这里的各成分是按照每升液体计算的，MS是组织培养中比较常规的培养基，固体MS培养基，在上述成分中添加琼脂粉；除菌率是指：经过步骤一的方法外植体灭菌后，再经过步骤二的方法培养2周后统计出的没有染菌的外植体数目在总共外植体中所占的百分比。存活率是指：经过步骤一的方法外植体灭菌后，再经过步骤二的方法培养2周后统计出的仍然是绿色(绿色部分占外植体总体积的1/3以上)且没有染菌的外植体数目在总共没有染菌的外植体中所占的百分比。实施例1(对照1)：1、步骤一，千层塔外植体的灭菌：取千层塔叶片，用流水冲洗干净，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡1分钟，倒掉乙醇，然后用体积分数为5％的NaOCl溶液浸泡15分钟后取出，倒掉NaOCl溶液，换用体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，放置10分钟后取出，倒掉过氧化氢溶液，用无菌水冲洗干净；步骤二，千层塔外植体的培养：将灭过菌的千层塔叶片转接到含有150mg/L两性霉素B的MS固体培养基上，然后放于培养室中培养。培培养条件为：温度为25℃,光照强度20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，其特征在于，该方法包括在低压环境中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌，灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养。

【技术特征摘要】
1.一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，其特征在于，该方法包括在低压环境中将千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌，灭菌后的千层塔外植体在低压环境中培养；所述的低压环境是指压力为40～60KPa。2.如权利要求1所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，其特征在于，所述的千层塔外植体指千层塔的根、千层塔的茎或千层塔的叶。3.如权利要求1或2所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，其特征在于，千层塔外植体采用灭菌剂进行灭菌包括：取千层塔外植体依次经流水冲洗、体积分数为75％的乙醇溶液浸泡、体积分数为5％的NaOCl溶液浸泡及体积分数为7％的过氧化氢溶液浸泡，千层塔外植体经NaOCl溶液和过氧化氢溶液浸泡时处于低压环境。4.如权利要求3所述的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，其特征在于，千层塔外植体在NaOCl溶液中浸...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭斌，任岩岩，何美娜，何玮，傅艳萍，尉亚辉，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61