一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法技术

一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，是以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列T1和T2；再分别构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒；再将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S‑H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切‑连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。本发明专利技术以茶树咖啡因合成酶为例，联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术，构建了包含茶树咖啡因合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础，同时对其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法。
技术介绍
茶树是我国重要的木本经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。我国不仅是世界上茶叶资源最丰富的国家，也是世界上茶叶资源最大的生产国、消费国和贸易国。然而，我国具有多抗及高品质的优良茶树品种不多。虽然我国一直非常重视茶树的品种改良工作，但由于茶树具有生长周期长、自交不亲和的特性，使得采用常规育种技术难以实现茶树育种工作取得突破性的进展。近年来分子育种及基因工程等现代分子生物学技术在水稻、西红柿、马铃薯等农作物品种改良中发挥了重要作用，也为茶树育种提供了新的途径。所以，茶树分子生物学研究成为了茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。近年来，茶树转录组测序工作取得了重要进展，目前Genbank已收录了约35万条茶树mRNA序列，几乎涵盖了茶树中所有功能基因编码序列。此外，我国茶树的全基因组测序工作也于几年前在数家单位开始启动，并已相继完成，茶树全基因组序列将会在短期内释放。然而，像其它植物一样，面对大量的基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’‑CTCACAAGCAGAGAAGGCT‑3’,靶序列T2为5’‑ATATCACTGCTGTGGCAGC‑3’；2)构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒：以pYLgRNA‑AtU3d‑LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；以pYLgRNA‑AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，...

【技术特征摘要】
1.一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’,靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’；2)构建靶序列T1和T2的sgRNA表达盒：以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别在两个PCR管中进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.4所示；重...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘硕谦，唐雨薇，田娜，刘丽萍，王若娴，梁恒，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43