一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法技术

一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，是以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列T1和T2；再分别构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒；再将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S‑H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切‑连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。本发明专利技术以茶树咖啡因合成酶为例，联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术，构建了包含茶树咖啡因合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础，同时对其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法。
技术介绍
茶树是我国重要的木本经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。我国不仅是世界上茶叶资源最丰富的国家，也是世界上茶叶资源最大的生产国、消费国和贸易国。然而，我国具有多抗及高品质的优良茶树品种不多。虽然我国一直非常重视茶树的品种改良工作，但由于茶树具有生长周期长、自交不亲和的特性，使得采用常规育种技术难以实现茶树育种工作取得突破性的进展。近年来分子育种及基因工程等现代分子生物学技术在水稻、西红柿、马铃薯等农作物品种改良中发挥了重要作用，也为茶树育种提供了新的途径。所以，茶树分子生物学研究成为了茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。近年来，茶树转录组测序工作取得了重要进展，目前Genbank已收录了约35万条茶树mRNA序列，几乎涵盖了茶树中所有功能基因编码序列。此外，我国茶树的全基因组测序工作也于几年前在数家单位开始启动，并已相继完成，茶树全基因组序列将会在短期内释放。然而，像其它植物一样，面对大量的基因序列，我们对其功能了解却是非常缺少，从而制约了基因资源的利用。因此，确定茶树新基因的功能并高效利用新基因是未来茶树分子生物学研究中一个非常重要的主题，也就是说茶树后基因组时代即将降临。随着现代分子生物技术的突飞猛进，新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedprotein9)将会在茶树功能基因研究中发挥重要作用，预计将成为茶树后基因组时代不可或缺的研究工具。基因组定点编辑技术是分子育种、基因的功能研究和遗传改造等重要工具，是通过某种途径对基因组DNA特定位点进行改造的一种手段。迄今为止，应用时间比较长的基因组编辑技术有锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技术。但由于这两项技术DNA结合结构域的改造较为复杂，对每一个基因位点的编辑都需要重新设计、合成和组装2个核酸酶，载体构建困难，成为限制其发展的瓶颈。科学家一直在寻找精确而简单的基因组编辑方法，直到2013年发现了CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术是通过一段RNA来识别靶位点，因而在设计和构建上更加简单，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性编辑。CRISPR/Cas9技术的出现，立即在整个生命科学领域掀起了席卷世界的一股“风暴”，短短几年内该技术迅速应用于世界各地的实验室，并成为基因组定点编辑的首选技术。CRISPR/Cas广泛存在于古生菌和细菌的基因组中，属自身免疫系统，可降解入侵的病毒或质粒DNA。在该免疫系统中，Cas蛋白(CRISP-associatedprotein)含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链，切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。CRISPR/Cas系统的组成结构比较固定，由CRISPR序列与Cas基因家族组成，其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列(Spacer)相间排列组成，间隔序列可特异识别外源DNA。在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相关基因，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割。CRISPR系统分为3种类型，现在常用的CRISPR/Cas系统由类型Ⅱ系统改造而来。类型Ⅱ系统的特征性蛋白为Cas9蛋白，具有加工产生CRISPRRNA(crRNA)和切割双链DNA功能。crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合体，此复合体一旦形成就能引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而tracrRNA/crRNA复合体可通过人工设计，融合crRNA与tracrRNA形成sgRNA(single-guidedRNA)，sgRNA足以引导Cas9对DNA的定点切割。sgRNA可以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞，对特异DNA序列剪切，从而促使DNA发生NHEJ(nonhomologousend-joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除，结合参见图1。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为选择性基因组编辑提供了一个简便而强大的工具。来自Streptococcuspyogenes的Cas9由于识别序列仅为2个碱基(GG)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的sgRNA的引导下同时修饰多个基因组靶点。目前植物CRISPR/Cas9系统已日趋完善，已在十多种植物中成功实现了定点基因组编辑，除了在本氏烟草拟南芥等模式植物上获得了成功，很快在小麦、玉米、水稻、高粱、西红柿以及甜橙等作物上也成功实现了CRISPR/Cas9的应用。最近，先后利用CRISPR/Cas9技术实现了木本植物杨树和观赏植物牵牛花基因组的定点编辑，将CRISPR/Cas9系统在植物中应用推上了新的领域。然而，到目前为止尚未见有关CRISPR/Cas9技术在茶树上的应用报道，其中一个重要的原因是针对茶树的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建技术尚不完善。本专利技术以茶树中咖啡因合成酶基因为例，建立了茶树CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，该方法步骤如下：1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中：靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’(SEQIDNo.1),靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’(SEQIDNo.2)；2)构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒：以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR(OverlappingPCR)反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’‑CTCACAAGCAGAGAAGGCT‑3’,靶序列T2为5’‑ATATCACTGCTGTGGCAGC‑3’；2)构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒：以pYLgRNA‑AtU3d‑LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；以pYLgRNA‑AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；3)利用限制性内切酶BsaI‑HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S‑H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切‑连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。...

【技术特征摘要】
1.一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’,靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’；2)构建靶序列T1和T2的sgRNA表达盒：以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别在两个PCR管中进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.4所示；重...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘硕谦，唐雨薇，田娜，刘丽萍，王若娴，梁恒，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43