一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：其中，R为-OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。与现有技术相比，本发明专利技术比率型pH荧光探针光稳定性好，选择性高，pH值检测范围广且灵敏度高，制备方法简单，能够用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于小分子荧光探针领域，涉及一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于吲哚半花菁结构的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
化学反应的进行或完成与pH值密切相关，而组织、细胞或酶的许多生理过程如细胞增殖或凋亡、离子运输、内吞作用、多药物耐药性或肌肉收缩等活动也与人体内的pH值紧密相关，pH值的改变还会通过间隙连接和信号通路的变化影响到突触传递、神经元兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动。pH值异常会引发一些疾病，如癌症或阿氏综合征，有报道指出细胞酸化是癌细胞凋亡的早期特征。在正常生理条件下，根据pH值不同可以把细胞划分为两个部分：酸性细胞器(pH＝4.5-6.0)及细胞质(pH＝6.8-7.4)。因此，细胞内酸性或碱性太强，都会引起细胞功能障碍。玻璃电极法是测定pH值的常用方法，但由于其存在电化学干扰或机械损伤等缺陷，而不适合用于活体和极端pH值的测定。荧光探针检测法是基于光学信号变化的pH值测定方法，是利用一些有机化合物的荧光特性来指示目标介质酸碱度的变化。用荧光探针测定pH值是一种非侵入性的方法，既不会破坏样品，同时具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低、细胞膜透过性好及测试方法简单等特点。荧光探针检测法不仅可以用于荧光显微学研究，还可以实时监测细胞内pH值的变化和动态分布。具有花菁染料结构的化合物具有优越的光谱性能，目前已经被广泛应用于生物标记、荧光成像以及靶向治疗等诸多领域。由于该类分子的光谱性能对周围环境的变化异常敏感，因而其也常被用于研究溶剂的极性性质。目前，基于这一特点，采用该结构并将其应用于溶液pH值检测的工作，特别是利用比值型荧光探针检测pH的工作受到更多的关注。相比于on-off型探针，比值型探针在检测时通过荧光光谱图两个峰变化对同一物质进行检测，使其具备了内在的自校准功能，因而检测结果更为准确和可靠。1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-甲基吲哚溴化物在游离状态下，其氮原子带正电荷，会离域在整个吲哚环上。当α-碳上接入供电子基团时，离域在吲哚环上的正电荷被中和，吲哚结构与供电子基团发生共轭，导致新分子的共轭程度增大，其电子轨道更稳定，所需的激发光能量更低，同时伴随有光谱的红移，因此该类化合物是一类较好的ICT机理荧光骨架。申请公布号为CN104086536A的中国专利技术专利公开了一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒。该专利技术提供的用于检测pH值的荧光探针的结构如下所示：该专利技术同时提供了该化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到取代吗啉甲基苯基二醇；(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，取代吗啉甲基苯基二醇与三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得上述化合物。该专利技术提供的用于检测pH值的试剂盒，包括上述化合物和溶剂。上述专利公布的技术方案中，制得的荧光探针及其专用检测试剂盒对溶液的pH值具有良好的响应性，能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶体pH值的测定，但其pH值检测范围较窄，且仅限于细胞溶酶体pH值的检测，适用范围较小，有很大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种光稳定性好、选择性高、合成方法简单且应用范围广的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：其中，R为-OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。当R为-OH时，该方法具体包括以下步骤：(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110-130℃加热回流4-6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70-90℃加热回流11-13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95℃加热回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：步骤(3)所述的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10-20:1。将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。作为优选的技术方案，所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5。将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。作为优选的技术方案，所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5。所述的缩合剂为DCC(中文名称为二环己基碳二亚胺)/DMAP(中文名称为4-二甲氨基吡啶)、DIC(中文名称为N,N-二异丙基碳二亚胺)/DMAP、EDC(中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/HOBt(中文名称为1-羟基苯并三唑)/NMM(中文名称为N-甲基吗啉)或HATU(中文名称为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)/NMM中的一种。步骤(1)所述的式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8-10，优选1:1:10。步骤(2)所述的式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8-10，优选1:1.2:10；步骤(3)所述的式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8-10，优选1:1.1:10。所述的酸性溶剂为冰醋酸，所述的有机溶剂A为乙腈，所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。所述的荧光探针用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。在实际应用时，可提前将本专利技术荧光探针存放于检测试剂盒中，当实验人员需要测定pH值时，直接取出使用，摆脱了繁重的试剂配制及优化过程，简化了操作。本专利技术基于1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-甲基吲哚溴化物，在其4号位上引入了苄基苯甲酸，苄基的引入使其光稳定性增强，可用于连续、长时间动态跟踪的荧光检...

【技术保护点】
一种比率型pH荧光探针，其特征在于，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：其中，R为‑OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种比率型pH荧光探针，其特征在于，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ
所示：
其中，R为-OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。
2.一种如权利要求1所述的比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，
当R为-OH时，该方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110-130℃加
热回流4-6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70-90℃加
热回流11-13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95℃加热
回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
3.根据权利要求2所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，
将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温
下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
4.根据权利要求3所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，
所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。
5.根据权利要求2所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，
将与及...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄楚森，吴庐陵，贾能勤，贾倜，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31