一株死谷芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株保藏号为CCTCC NO:M2016020的死谷芽孢杆菌WMOO5，该菌可稳定的定植于西瓜植株中，并有效的防止西瓜枯萎病的发生，使用时，可将该菌制备成菌含量为1010cfu/mL的菌液，对大田中的西瓜苗进行灌根，已到达预防西瓜枯萎病的目的，该菌剂防效高，使用方便，宜于大规模推广应用。

A strain of Bacillus subtilis and its application in the valley

The invention provides a preservation number of WMOO5 CCTCC Valley Bacillus NO:M2016020, this bacterium can stable colonization in watermelon plants, and effectively prevent the occurrence of Fusarium Wilt of watermelon, when in use, the bacteria were prepared for bacteria content of bacteria 1010cfu/mL, in the field of West melon filling have arrived at the root, to prevent watermelon Fusarium wilt, the anti bacteria effect is high, easy to use, suitable for large-scale popularization and application.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是一株死谷芽孢杆菌WMOO5（BacillusvallismortisWM005）及其在防治西瓜枯萎病中的应用
技术介绍
枯萎病(Blight)是西瓜的一种毁灭性病害，在世界各西瓜产区分布广泛。随着我国农业产业结构的调整，西瓜种植面积越来越大，连作障碍已成为制约西瓜生产的重要因素。西瓜枯萎病是西瓜连作障碍的主要病害之一，其病原菌是尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxyporumf.sp.niveum)。随着西瓜逐年连作和重茬，西瓜枯萎病发生日趋严重，造成西瓜大量减产，一般病田间减产30%～40%，重病田则可减产80%以上甚至绝产，造成严重的经济损失，严重限制了西瓜生产。虽然可以从筛选抗性品种、加强栽培等措施进行综合防治西瓜枯萎病，但目前化学药剂防治是控制西瓜枯萎病的重要而有效方法。目前国内已筛选出了一些有效的药剂，如25%咪鲜胺EC、70%恶霉灵WP、50%多·霉威WP、50%异菌脲WP、50%咪鲜胺锰盐WP、32.5%苯甲嘧菌酯SC以及30%苯甲丙环唑EC等药剂对西瓜枯萎病的有较好的防治效果。但长期使用化学杀菌剂不仅造成西瓜枯萎病菌的抗药性逐年增加，同时也会产生农药残留等问题，随着现代社会的发展，人们对环境保护和自身健康的关注，生防微生物以其低毒、对人类健康安全等优势，已越来越多的应用于农业植物病害防治。生物防治是植物病虫害综合治理的重要手段，对实现农业的可持续发展具有重大意义，而分离与筛选高效生防微生物则是实现生物防治的前提。芽孢杆菌(Bacillussp.)是人类发现最早的细菌之一，分布广泛，其抑制病原菌的范围很广、抗性强、无毒副作用，在动植物的生物防治中，应用比较广泛。芽孢杆菌可产生肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等抗菌物质，不同种类的抗菌物质有不同的生物学活性，因此芽孢杆菌所分泌的胞外抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒等多种致病因子。目前芽孢杆菌用于植物土传病害的例子很多，例如在美国获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可的枯草芽孢杆菌的生防菌株中，GBO3、FZB24都可以用于枯萎病的防治；王雅平用分离至丝瓜土壤的枯草芽孢杆菌（B.subtilus）TG26浸根处理西瓜和烟草幼苗，对西瓜枯萎病和烟草青枯病的田间防效分别73.1%和79.6%，并有明显的增产效应；死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)是枯草芽孢杆菌的近亲，可以对多种植物病害菌株产生拮抗作用。林英等报道的一株死谷芽孢杆菌菌株CZ（“一株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及抗病促生效果初探”，北方园艺）具有广谱的抑菌效果，通过平板对峙法研究表明，该菌株对立枯丝核菌、香瓜枯萎病、水稻恶苗病、苹果炭疽病原菌都具较强的拮抗作用，对西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病、小麦赤霉病有较好的抑制作用，该CZ菌株扫描电镜观察菌体为杆状，端圆，无鞭毛。16SrDNA序列分析该菌株属于芽孢杆菌属，系统进化树分析结果表明CZ与已知菌Bacillusmojavensis的亲缘关系最近在同一分支上。经生理生化鉴定初步确定为死谷芽孢杆菌（BacillusvallismortisCZ），对西瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，但该菌抑菌直径在2-5mm之间，抑菌圈较小，抑菌能力较弱，很难满足农业生产需求。
技术实现思路
本专利技术提供一株死谷芽孢杆菌WMOO5，能够有效的防治在防治西瓜枯萎病，本专利技术是这样实现的：一株死谷芽孢杆菌WMOO5（BacillusvallismortisWM005），其保藏号为CCTCCNO:M2016020；所述死谷芽孢杆菌WMOO5为革兰氏阳性菌株，菌体呈杆状，无鞭毛，两端钝圆，产生椭圆形芽孢，该菌株在LB培养基上菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱，易挑起。保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WMOO5在防治西瓜枯萎病中的应用。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WMOO5在防治西瓜枯萎病中的应用，具体为：在西瓜苗定植大田后，向西瓜苗根部灌死谷芽孢杆菌WMOO5菌液，400mL/株，用以防治西瓜枯萎病。进一步，本专利技术所述死谷芽孢杆菌WMOO5菌液的制备方法为：（1）挑取保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WM005至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200rpm摇床振荡培养12-24h；（2）向含有种子培养基的发酵罐中，按照体积比1:9的接种量接种菌株，于25-38℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；（3）按体积比10%的接种量向种子培养基中接种液体种子，于30-35℃，150rpm摇床振荡下避光培养24h，得到活菌体培养物；（4）取活菌体培养物于4℃、5000rpm条件下离心15min，取沉淀用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次，调节至菌含量为1010cfu/mL，即获得死谷芽孢杆菌WMOO5菌液。本专利技术获得的保藏编号为CCTCCNO:M2016020的菌株对西瓜枯萎病菌具有强烈的拮抗作用，PDA平板平板对峙实验中该菌株对西瓜枯萎病菌的抑菌带直径4.0cm，抑菌率为80.0%，以该菌株制备的菌剂浓度在107-108cfu/mL左右时，能够在土壤和西瓜植株中稳定定植并有效防止西瓜枯萎病的发生，与对照相比发病率下降69.5%。大田试验结果表明，生防菌WM005对西瓜枯萎病的防效（86.7%）显著高于化学药剂多菌灵的防效（73.3%），具有极高的应用推广价值。附图说明图1为菌株WM005电镜图片。图2为菌株WM005的16SrDNA序列的邻接系统发育树示意图。图3为菌株WM05在PDA培养基上对西瓜枯萎病菌的抑制作用示意图。图4为菌株WM05对西瓜枯萎病的室内防治试验效果示意图。具体实施方式本专利技术技术方案生产的对植物内生菌剂能够高效防治西瓜枯萎病菌引起的枯萎病。以下通过具体实施例详细说明本专利技术的实施，目的在于帮助读者更好地理解本专利技术的精神实质，但不作为对本专利技术实施范围的限定。实施例涉及的培养基：LB固体培养基（菌种保藏培养基）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1L，pH7.0-7.5；LB培养液（菌种活化培养基）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH7.0-7.5；种子培养基（液体，1L）：K2HPO44.8g，KH2PO43.5g，（NH4）2SO42g，MgCl20.16g，CaCl20.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株死谷芽孢杆菌WMOO5（Bacillus vallismortis WM005），保藏号为CCTCC NO:M2016020；所述死谷芽孢杆菌WMOO5为革兰氏阳性菌株，菌体呈杆状，无鞭毛，两端钝圆，产生椭圆形芽孢，该菌株在LB培养基上菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱，易挑起。

【技术特征摘要】
1.一株死谷芽孢杆菌WMOO5（BacillusvallismortisWM005），保藏号为CCTCCNO:
M2016020；所述死谷芽孢杆菌WMOO5为革兰氏阳性菌株，菌体呈杆状，无鞭毛，两端钝圆，产
生椭圆形芽孢，该菌株在LB培养基上菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱，易挑起。
2.如权利要求1所述的死谷芽孢杆菌WMOO5在防治西瓜枯萎病中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，具体步骤如下：西瓜苗移栽大田后，以死谷芽孢
杆菌WMOO5菌液灌根，400mL/株，用以防治西瓜枯萎病。
4.根据权利要求书所述应用，其特征在于，所述死谷芽孢杆菌WMOO5菌液是这样获得
的：
（1）挑取保藏号为CCTCCNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：余向阳，王琼，张猛，葛静，程金金，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32