一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC。本发明专利技术涉及一种来源于潮间带污泥的不动杆菌（Acinetobactersp.C26），该菌株具有营养条件简单、易培养、代时短的特点；使用本发明专利技术的菌株生产硫酸软骨素酶活力高、稳定性好、成本低的特点，能够实现大规模培养，满足工业化的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC
本专利技术属于生物
，具体涉及一种不动杆菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC。
技术介绍
硫酸软骨素（Chondroitinsulfate）是一种酸性粘多糖，以葡萄糖醛酸和氨基己糖形成的双糖单位，交替连接而成的一类大分子多糖，广泛分布于动物和人的软骨中，如动物喉骨、鼻骨、软骨，肌膜和血管壁等。硫酸软骨素有多种异构体，根据硫酸基在氨基已糖所处的不同位置，又可将其分为硫酸软骨素A（二糖单位：→4GlcAβ1,3GalNAc4Sβ1→）、硫酸软骨素B（二糖单位：→4IdoAα1,3GalNAc4Sβ1→）、硫酸软骨素C（二糖单位：→4GlcAβ1,3GalNAc6Sβ1→）、硫酸软骨素D（二糖单位：→4GlcA2Sβ1,3GalNAc6Sβ1→）等。最新研究报道显示，硫酸软骨素的分子量与其生物活性、药理作用有一定的相关性，特别是低分子量的硫酸软骨素，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更显著的疗效。硫酸软骨素酶（ChSase）是一类能将硫酸软骨素、软骨素等糖胺聚糖降解为不饱和二糖（△Di）及寡糖的裂解酶，主要来源于微生物。根据硫酸软骨素酶作用的底物不同可分为硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶C、硫酸软骨素酶ABC。目前最主要用于药用价值研究中的是硫酸软骨素酶ABC，可降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素B（硫酸皮肤素）和硫酸软骨素C。ABC酶降解硫酸软骨素A、B或C的产物可通过紫外可见分光光度计于波长232nm处检测，此酶通过β消除机理作用于二糖重复单元之间的β-1,4糖苷上并将其切断。基于降解原理硫酸软骨素酶具有药理活性，包括溶解椎间盘内髓或破裂的纤维环、降解囊性纤维变性部位的粘液物、阻止玻璃体与视网膜的粘连、促进神经轴的再生、抗肿瘤以及增强软骨细胞与软骨的粘附力等，可用于新药的研发。近年来，硫酸软骨素酶在研究机体蛋白聚糖结构与功能、开发新型药用酶、制备低聚硫酸软骨素及寡糖等方面有重要用途，日益受到研究人员的关注。本专利技术人通过查阅相关的资料，发现目前报道有来源于肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）的三种硫酸软骨素酶，分子量74kDa、41.8kDa和55.2kDa（KenanGU等）；来源于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的硫酸软骨素酶，分子量71.2kDa（陶科等）；来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)的硫酸软骨素酶，分子量75kDa（JamesFethiere等）；来源于温和气单胞菌（Aeromonassobria）的硫酸软骨素酶，分子量80kDa（阎浩林等）；来源于少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonaspaucimobilis）的硫酸软骨素酶，分子量82.3kDa（刘万顺等）；来源于普通变形杆菌（Proteusvulgaris）的两种硫酸软骨素酶，分子量100kDa和105kDa（AkioHamai等）；来源于多形拟杆菌（Bacteroidesthetaiotaomicron）的两种硫酸软骨素酶，分子量104kDa和108kDa（专利号：CN102277345A）。通过大量信息检索，同时在产酶微生物与酶的分子量两方面比对，未发现有与本专利技术人研究的硫酸软骨素酶ABC相同的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种不动杆菌及其产生的硫酸软骨素酶ABC，本专利技术分离纯化出一株来源于海洋的不动杆菌Acinetobactersp.C26，其特征是产生硫酸软骨素酶ABC，并对其进行生物材料保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏号为：CCTCCM2015654。保藏日期为：2015年10月30日，利用该菌株通过液体发酵可以获得活力高、稳定性好、成本低的硫酸软骨素酶ABC。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种不动杆菌，其分类命名为不动杆菌Acinetobactersp.C26，保藏编号：CCTCCM2015654。该菌株对数期细胞直径约为1.0-1.5μm×1.5-2.5μm，24h后菌落直径为2-3mm，菌落呈圆形，边缘光滑。本专利技术还提供了所述的不动杆菌液体发酵生产的硫酸软骨素酶ABC，它通过以下制备方法制得：（1）将所述不动杆菌Acinetobactersp.C26斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在培养温度18℃-37℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得种子培养液；（2）将步骤（1）所述的种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，在培养温度18℃-30℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得硫酸软骨素酶ABC发酵液；（3）离心或过滤分离步骤（2）所述硫酸软骨素酶ABC发酵液，取上清液；（4）用硫酸铵沉淀步骤（3）所述上清液，离心或过滤收集粗蛋白；（5）缓冲液复溶步骤（4）收集的粗蛋白，超滤或透析除去小分子杂质，得到纯化的硫酸软骨素酶ABC。（6）将步骤（5）中得到的酶液进行阴离子交换柱层析，用pH7.5的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱所述交换柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分。（7）将步骤（6）中得到的具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分进行5倍浓缩及凝胶过滤柱层析，用pH6-8的缓冲液洗脱所述凝胶柱，分离具有硫酸软骨素酶ABC活性的蛋白质组分。制得的所述硫酸软骨素酶ABC的分子量为76.1kDa。本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术涉及一株来源于海洋的不动杆菌Acinetobactersp.C26。经过基因测序，发现其遗传标志是包含序列表所示的16SrDNA核酸序列，通过在GenBank数据库同源比对和生理生化鉴定，确定其为不动杆菌属，命名为Acinetobactersp.C26。该菌株在发酵产酶培养基中培养24h，发酵液中硫酸软骨素酶活力达到最高，用本专利技术的菌株生产制备硫酸软骨素酶ABC，具有产品活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。本专利技术涉及一种来源于Acinetobactersp.C26的硫酸软骨素酶ABC，该酶的特征在于是一种可以分别作用于硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C使其降低粘度和生成不饱二糖和低聚糖，菌株Acinetobactersp.C26通过液体培养获得含酶发酵液，发酵液中硫酸软骨素酶ABC活力高达1.3×104U/L；发酵液通过液体发酵、冷冻离心、硫酸铵沉淀法收集、超滤或透析，获得纯化的硫酸软骨素酶ABC，将纯化的硫酸软骨素酶ABC通过Q-Sepharose®FastFlow阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析技术处理，获得一种电泳纯的硫酸软骨素酶ABC。通过标准蛋白检测出该酶的分子量为76.1kDa（如图1所示），其分子量不同于已有报道该属所产的硫酸软骨素酶ABC。附图说明图1：纯化后的硫酸软骨素酶ABC经SDS-PAGE电泳后结果。左边为标准蛋白分子量，右边为不动杆菌Acinetobactersp.C26制备并经纯化的硫酸软骨素酶ABC单带，数量表示单位：kDa。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术做进一步说明1.一株Acinetobactersp.C26菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不动杆菌，其特征在于分类名为不动杆菌Acinetobacter sp.C26，该菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏日期：2015年10月30日，保藏号：CCTCC NO：M 2015654。

【技术特征摘要】
1.一种不动杆菌（Acinetobactersp），该菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学；保藏日期：2015年10月30日，保藏号：CCTCCNO：M2015654。2.根据权利要求1所述的不动杆菌，其特征在于：该菌株可以用来生产硫酸软骨素酶ABC。3.权利要求1所述的不动杆菌生产的硫酸软骨素酶ABC，其特征在于它通过以下制备方法制得（1）将斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在培养温度18℃-37℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得种子培养液；（2）将步骤（1）所述的种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，在培养温度18℃-30℃、转速120-180rpm的条件下培养16-48h，获得硫酸软骨素酶AB...

【专利技术属性】
技术研发人员：江晓路，朱常亮，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37