一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法组成比例

本发明专利技术涉及一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法。包括：外植体的灭菌、无菌苗获得培养基、继代培养基、生根培养基和移栽五个步骤。培养方法采用芽作为外植体，在B5培养基中添加细胞分裂素、生长素、维生素C、谷胱甘肽、苯甲酸钠、蔗糖和琼脂构成预防褐化培养基配方，实现了天女木兰组培过程中褐化的防控。本方法重复性好，芽褐化率低于10％，生根率 75％～80％，移栽成活率85％～90％，对于保护天女木兰种质资源及其开发利用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织培养领域，涉及一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法。
技术介绍
天女木兰(MagnoliasieboldiiK.Koch)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)的落叶小乔木，国家三级濒危树种。天女木兰兼有观赏、芳香和药用价值,是一种很有开发前景的珍稀野生木本植物资源。天女木兰芽组织培养过程中，外植体褐化现象经常发生。褐化严重影响外植体的脱分化和再分化，造成培养失败，这已成为天女木兰组织培养中的棘手问题，同时也成为天女木兰快繁体系建立的一大障碍,目前还没有令人满意、有效防止天女木兰组培褐化现象的方法。天女木兰褐化产生的机理与许多木本植物相同，褐化主要是多酚氧化酶（PPO）作用于天然底物酚类物质引起的；PPO是植物体中普遍存在的一种末端氧化酶，正常情况下细胞内的酚类物质和PPO呈区域性分布，酚类物质分布在液泡中，PPO分布在质体和细胞质中且与膜结合呈潜伏状态；当外植体被切割时，膜结构瓦解，PPO受到活化与酚类物质接触，将酚氧化成醌类物质产生褐化现象。醌类物质在酪氨酸酶的作用下，与外植体中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。根据现有文献人们进行天女木兰组织培养通常采用B5培养基，其原因是B5培养基相对MS等其它类型培养基褐化较轻（杜凤国2007年）。目前预防天女木兰芽组培褐化现象，主要采取以下二种方法。1、培养基中添加抗氧化剂，比如：维生素C和半胱氨酸等抗氧化剂，其作用是防止外植体释放的酚类物质被氧化，对酚类物质具有保护作用；2、在培养基中加入吸附剂，比如：活性炭或聚乙烯比咯烷酮，其作用是把外植体体释放的酚类物质及氧化形成的醌类物质吸附，从而达到防止外植体褐化目的（王欢2012年）。尽管具有一定的预防褐化效果，但是对于不同月份取的芽进行组织培养，其防止褐化效果差异较大，结果还不能令人满意，至今还未有有效预防天女木兰芽组培褐化培养基的配方及方法。
技术实现思路
本专利技术目的针对天女木兰芽组培褐化严重问题，提出一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法。本专利技术解决的技术问题采用如下技术方案：在B5培养基中添加适量抗氧化剂(维生素C和谷胱甘肽)与多酚氧化酶抑制剂(苯甲酸钠),形成有效预防天女木兰芽组培褐化配方及方法。配方分为无菌苗培养基（初代培养）、继代培养基和生根培养基配方。一种天女木兰无菌苗培养基配方，其特征包括如下组分:在B5培养基中添加细胞分裂素6－苄基腺嘌呤（以下简称6－BA）0.5mg/L、生长素萘乙酸（以下简称NAA）0.3mg/L、维生素C（以下简称Vc）300～500mg/L、谷胱甘肽（以下简称GSH）50～150mg/L、苯甲酸钠30～50mg/L和蔗糖30g/L，调pH5.6-5.8。继代培养基配方,其特征包括如下组分：在培养基B5中添加细胞分裂素噻苯隆（以下简称TDZ）0.3mg/L、NAA0.3mg/L、Vc300～500mg/L、GSH100～150mg/L、苯甲酸钠30～50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。生根培养基配方，其特征包括如下组分：在1/2B5培养基中添加NAA0.5mg/L、维生素C300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。本专利技术的有益效果（1）本方法采取添加抗氧化剂和多酚氧化酶抑制剂，从多条途代谢途径上预防天女木兰芽组培褐化现象。本配方预防褐化效果显著，褐化率小于10%，预防了天女木兰芽组培褐化率高的问题。（2）培养基中添加两种抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽，具有以下优点：抗氧化能力强，对外植体释放的酚类物质具有较强保护作用；对植物生长及自然环境没有毒副作用；水溶性好、使用方便。配方中同时添加两种抗氧化剂，其预防褐化效果优于使用单一抗氧化剂。（3）培养基中添加适量多酚氧化酶抑制剂苯甲酸钠，具有抑制多酚氧化酶活性强、水溶性好、使用方便等优点，不但能抑制多酚氧化酶活性，还能起到一定程度杀菌作用，减少培养基的杂菌污染几率。具体实施方式实施例1（1）取材：于四月初取一年生枝条，在室内水培8～10d，待芽萌动后，取顶芽和侧芽（长度0.5～1.0cm），放入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对其表面消毒30s，用无菌水冲洗2～3次,然后用0.1%HgCl2处理7～8min,用无菌水冲洗5～6次，接种。（2）无菌苗获得（初代培养）：将经步骤（1）消毒后的芽，接种于培养基中培养，在B5培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、Vc300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸钠30mg/L和蔗糖30g/L，pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C光照强度1500～2000lx.培养30d,得无菌苗，褐化率小于10%。（3）增殖培养（继代培养）：将步骤（2）得到的无菌苗接种于继代培养基中培养。培养基配方为B5培养基添加TDZ0.3mg/L、NAA0.3mg/L、VC300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸钠30mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d,获丛生芽，褐化率小于10%。（4）生根培养:将步骤（3）获得的丛生芽分切成单芽进行生根培养，生根培养基配方为1/2B5培养基、NAA0.5mg/L、Vc300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d生根，生根率75～80％，褐化率小于10%。（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养势室内放置3d后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V（苔藓）：V(蛭石)＝1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3％高锰酸钾溶液喷洒消毒。移栽后温度保持在18～20゜C,相对湿度在85～90％,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定根、新叶，移栽成活率85％。实施例2（1）取材：于五月中旬取当年生枝条，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法，其特征包括以下步骤：（1）取材：于春季和夏初取顶芽和侧芽，芽长度为0.5～1.0cm，放入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对其表面消毒30s，用无菌水冲洗2～3次,然后用0.1% HgCl2处理7～8min,用无菌水冲洗5～6次，接种；（2）一种预防天女木兰无菌苗褐化培养基配方，其特征包括如下组分:在B5培养基中添加细胞分裂素6－苄基腺嘌呤0.5mg/L 、生长素萘乙酸0.3mg/L、维生素C 300～500mg/L、谷胱甘肽100～150mg/L、苯甲酸钠30～50mg/L和蔗糖30g/L，调pH 5.6～5.8；（3）继代培养基配方,其特征包括如下组分：在B5培养基中添加细胞分裂素噻苯隆0.3mg/L、萘乙酸0.3 mg/L、维生素C 300～500mg/L、谷胱甘肽100～150 mg/L、苯甲酸钠30～50 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH 5.6～ 5.8；（4）生根培养基配方，其特征包括如下组分：在1/2 B5培养基中添加萘乙酸0.5mg/L、维生素C 300mg/L、谷胱甘肽 50mg/L 、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH 5.6～ 5.8；（5）炼苗移栽：获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养室内放置3d后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V（苔藓）：V(蛭石)＝1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3％高锰酸钾溶液喷洒消毒；移栽后温度保持在18～20゜C,相对湿度在85～90％,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定根、新叶，移栽成活率85％～90％。...

【技术特征摘要】
1.一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法，其特征包括以下步骤：
（1）取材：于春季和夏初取顶芽和侧芽，芽长度为0.5～1.0cm，放入洗洁精溶液中浸泡
20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对其表面消毒30s，用无
菌水冲洗2～3次,然后用0.1%HgCl2处理7～8min,用无菌水冲洗5～6次，接种；
（2）一种预防天女木兰无菌苗褐化培养基配方，其特征包括如下组分:在B5培养基中添
加细胞分裂素6－苄基腺嘌呤0.5mg/L、生长素萘乙酸0.3mg/L、维生素C300～500mg/L、谷
胱甘肽100～150mg/L、苯甲酸钠30～50mg/L和蔗糖30g/L，调pH5.6～5.8；
（3）继代培养基配方,其特征包括如下组分：在B5培养基中添加细胞分裂素噻苯隆
0.3mg/L、萘乙酸0.3mg/L、维生素C300～500mg/L、谷胱甘肽100～150mg/L、苯甲酸钠30
～50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8；
（4）生根培养基配方，其特征包括如下组分：在1/2B5培养基中添加萘乙酸0.5mg/L、维
生素C300mg/L、谷胱甘肽50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500mg/L、蔗糖3g/L和琼脂
7g/L，调pH5.6～5.8；
（5）炼苗移栽：获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养室内放置3d后，用镊子将组
培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V（苔...

【专利技术属性】
技术研发人员：高红兵，王欢，姜莹，杜凤国，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22