双重衍生化壳聚糖纳米颗粒及制备方法和使用其体内基因转移的方法技术

本文提供了包含用阳离子氨基酸和亲水性多元醇官能化的壳聚糖的壳聚糖‑衍生物纳米颗粒；和制备方法及使用其如体内基因递送的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双重衍生化壳聚糖纳米颗粒及制备方法和使用其体内基因转移的方法专利
本专利技术一般涉及包含双重衍生化壳聚糖的纳米颗粒，及制备方法和使用其递送核酸如体内基因转移的方法。专利技术背景壳聚糖是N-乙酰基-D-葡糖胺与D-葡糖胺的无毒阳离子共聚物。壳聚糖可与核酸形成复合物，并作为一种生物相容且无毒的多糖已经用作DNA递送媒介物来转染细胞。由于病毒载体的复杂性和潜在毒性，所以将壳聚糖用于核酸的非病毒递送中引起了人们的极大兴趣。为了鉴别非常适合基因转染的组合物，已经检查了许多壳聚糖/DNA复合物，包括经过修饰的壳聚糖与核酸的复合物。参见如WO2010/088565；WO2008/082282。已经发现所述复合物除其它性质之外在溶解性、聚集倾向、复合物稳定性、粒度、释放DNA的能力和转染效率方面不同。因此，需要具有改善的转染效率的用于体内基因转移的新型组合物和方法。本文所述的组合物和方法有助于满足这些和其它需求。专利技术概述本文提供了令人惊讶的发现：用特定Arg:HP比率的(1)精氨酸(Arg)和(2)亲水性多元醇(HP)官能化的壳聚糖展现出显著改善的转染效率。精氨酸和葡萄糖酸已显示可协同用作提高壳聚糖纳米颗粒的转染效率的官能团。参见如PCT/CA2013/050218。本文公开了令人惊讶的发现：其它分子可被葡萄糖酸取代成壳聚糖的衍生物，并仍然表现出该协同作用。此外，提供在衍生化壳聚糖展现出最大转染效率内的两种取代基的优化官能化程度比率。因此，本文提供了促进如体内递送核酸至细胞、组织和器官的新型组合物。特别地，本文提供了基于双重衍生化壳聚糖的纳米颗粒，其中所述壳聚糖用阳离子氨基酸精氨酸(Arg)和亲水性多元醇(HP)以优化的Arg最终官能化程度：HP最终官能化程度(即Arg:HP)比率官能化。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒包含与多个精氨酸和多个亲水性多元醇偶联的壳聚糖，参见如式I其中n是1至650的整数，α是精氨酸的官能化程度，β是亲水性多元醇的官能化程度，且每个R1独立地选自氢、乙酰基、精氨酸和亲水性多元醇。在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒包含与精氨酸偶联的壳聚糖。参见式II。在一个优选的实施方案中，所述精氨酸有助于提高壳聚糖的溶解度和/或使衍生化壳聚糖在较高的pH下结合核酸。在另一个实施方案中，所述纳米颗粒包含与亲水性多元醇偶联的壳聚糖，所述亲水性多元醇优选具有用于偶联至壳聚糖的羧基或醛基。在一个实施方案中，所述亲水性多元醇选自由具有用于偶联至壳聚糖的羧基或醛基的分子和糖组成的组，其中所述亲水性多元醇不是葡萄糖酸。在一个实施方案中，所述亲水性多元醇具有羧基。在一个实施方案中，所述具有用于偶联至壳聚糖的羧基的亲水性多元醇选自由葡萄糖酸和苏糖酸组成的组。在一个实施方案中，所述亲水性多元醇是葡萄糖酸，参见如式III。在另一个实施方案中，所述亲水性多元醇是苏糖酸，参见如式IV。在另一个实施方案中，所述亲水性多元醇是可为天然或合成的糖，或者糖的酸形式。非限制性实例包括甘油醛、苏阿糖、赤藓糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、葡萄糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。在一个实施方案中，所述亲水性多元醇是葡萄糖，参见如式V。在一个实施方案中，所述亲水性多元醇是苏阿糖，参见如式VI。如本文所述的双重衍生化壳聚糖包含优化的Arg:HP最终官能化程度比率的精氨酸和亲水性多元醇。在一个优选的实施方案中，所述双重衍生化壳聚糖具有约1:1至约10:1的Arg:HP最终官能化程度比率或摩尔比率。在另一个实施方案中，所述Arg:HP最终官能化程度比率为约3:1至约7:1。在另一个实施方案中，所述Arg:HP最终官能化程度比率为约5:1。特别地，与此类双重衍生化壳聚糖(“DD-壳聚糖”)形成的壳聚糖-核酸多聚物比与非官能化壳聚糖形成的核酸多聚物、仅衍生化壳聚糖或Arg:HP最终官能化程度比率为1:1至10:1的双重衍生化的壳聚糖展现出更高的转染效率。通过在本文所述的多聚物中使用双重官能化壳聚糖所赋予的其它所需的性质包括改善的穿透粘膜屏障的能力、在大于6.5的pH下增强的多聚物稳定性、在高多聚物浓度下减少的聚集、减少的细胞毒性和增强的核酸胞内释放。此外，在一些优选的实施方案中，主题DD-壳聚糖多聚物组合物可在生理pH下施用(如全身施用)。因此，在一方面，本专利技术提供了DD-壳聚糖核酸多聚物。所述DD-壳聚糖核酸多聚物包含被精氨酸和亲水性多元醇双重衍生化的壳聚糖。在一个实施方案中，所述DD-壳聚糖核酸多聚物的核酸是DNA。在一个实施方案中，所述DD-壳聚糖核酸多聚物的核酸是RNA。在一个实施方案中，所述DD-壳聚糖核酸多聚物的核酸是人工核酸。在一个优选的实施方案中，所述人工核酸选自由肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏阿糖核酸(TNA)组成的组。在一个实施方案中，所述DD-壳聚糖核酸多聚物的核酸是治疗性核酸。在一个实施方案中，所述治疗性核酸是治疗性RNA。在一个优选的实施方案中，所述治疗性RNA选自由反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微小RNA和酶促RNA组成的组。在一个实施方案中，所述治疗性核酸是DNA。在一个实施方案中，所述治疗性核酸包含编码治疗性蛋白质的核酸序列。在一方面，本专利技术提供了包含多种DD-壳聚糖核酸多聚物的组合物。在一个实施方案中，所述组合物具有3.0-8.0、更优选4.0-7.0且最优选4.5-6.5的pH。在一方面，本专利技术提供了包含本专利技术的DD-壳聚糖核酸多聚物的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述DD-壳聚糖核酸多聚物包含治疗性核酸。在一方面，本专利技术提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本专利技术的药物组合物。在一个实施方案中，主题药物组合物在生理pH下施用。在一个实施方案中，主题药物组合物全身施用。在一个实施方案中，主题药物组合物局部施用至靶组织。在一个优选的实施方案中，主题药物组合物施用至粘膜组织。在一个实施方案中，所述粘膜组织是胃肠(GI)组织。在一方面，本专利技术提供了包含DD-壳聚糖核酸多聚物的疫苗，其中所述核酸编码抗原。在一方面，本专利技术提供了用于接种患者的方法。所述方法包括向患者施用本专利技术的疫苗。在一方面，本专利技术提供了包含DD-壳聚糖核酸多聚物的免疫原性组合物，其中所述核酸编码免疫原。在一方面，本专利技术提供了用于开始或增加对目标分子的免疫反应的方法。所述方法包括向患者施用本专利技术的免疫原性组合物，其中所述核酸编码目标分子的表位。在另一方面，本专利技术提供了调控免疫反应的方法，所述方法包括向患者施用本专利技术的壳聚糖-核酸多聚物，其中所述核酸编码免疫调节细胞因子。附图概述图1显示了仅用葡萄糖酸以3％或10％的最终官能化程度官能化、仅用精氨酸以10％的最终官能化程度官能化或者用葡萄糖酸和精氨酸两者以约1:1或约3.3:1的精氨酸与葡萄糖酸最终官能化程度比率官能化的5kDa壳聚糖(x-轴)的体外转染效率(ngSEAP/mg蛋白质；y-轴)。图2显示了仅用葡萄糖酸以3％至10％的最终官能化程度官能化、仅用精氨酸以52％的最终官能化程度官能化或者用葡萄糖酸和精氨酸两者以约6:1或约17:1的精氨酸与葡萄糖酸最终官能化程度比率官能化的5k本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖‑衍生物纳米颗粒，其包含用精氨酸(Arg)和式VII的亲水性多元醇(HP)官能化的壳聚糖：其中：R2选自：H和羟基；R3选自：H和羟基；且X选自：被一个或多个羟基取代基任选取代的C2‑C6亚烷基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.25 US 61/882,5001.壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其包含用精氨酸(Arg)和式VII的亲水性多元醇(HP)官能化的壳聚糖：其中：R2选自：H和羟基；R3选自：H和羟基；且X选自：被一个或多个羟基取代基任选取代的C2-C6亚烷基；前提是所述亲水性多元醇不是葡萄糖酸。2.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述亲水性多元醇具有羧基。3.如权利要求2所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述亲水性多元醇是苏糖酸。4.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述亲水性多元醇是选自由以下组成的组的糖：甘油醛、苏阿糖、赤藓糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、葡萄糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。5.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述亲水性多元醇选自由以下组成的组：2,3-二羟基丙酸；2,3,4,5,6,7-六羟基庚醛；2,3,4,5,6-戊羟基己醛；2,3,4,5-四羟基己醛；和2,3-二羟基丙醛。6.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其包含含在官能化前平均分子量小于65kDa、平均小于400葡糖胺单体单元、N/P比率为2至20、平均流体力学直径小于500nm、在酸性pH下平均ζ电势至少0mV、多分散指数(PDI)小于0.5且核酸浓度大于0.5mg/ml的壳聚糖分子的壳聚糖-核酸多聚物，其中所述壳聚糖-核酸多聚物基本上不含沉淀的多聚物，并且所述壳聚糖-核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少6小时内它们的平均直径增加小于100％。7.如权利要求6所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖-核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少12小时内它们的平均直径增加小于100％。8.如权利要求7所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖-核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少24小时内它们的平均直径增加小于100％。9.如权利要求8所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖-核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少48小时内它们的平均直径增加小于100％。10.如权利要求6所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中在室温下在至少6小时内所述壳聚糖-核酸多聚物的平均直径增加小于50％。11.如权利要求7所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中在室温下在至少12小时内所述壳聚糖-核酸多聚物的平均直径增加小于50％。12.如权利要求8所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中在室温下在至少24小时内所述壳聚糖-核酸多聚物的平均直径增加小于50％。13.如权利要求9所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中在室温下在至少48小时内它们的平均直径增加小于100％。14.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有1:1至10:1的Arg最终官能化程度：HP最终官能化程度比率。15.如权利要求14所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述Arg最终官能化程度：HP最终官能化程度比率为3:1至7:1。16.如权利要求15所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述Arg最终官能化程度：HP最终官能化程度比率为5:1。17.如权利要求4所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述亲水性多元醇是葡萄糖。18.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖衍生物具有3-110kDa的平均分子量。19.如权利要求18所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖衍生物具有5-25kDa的平均分子量。20.如权利要求1所述的壳聚糖-衍生物纳米颗粒，其中所述壳聚糖衍生物具有小于25kDa的平均分子量。21.一种组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的纳米颗粒，其中所述壳聚糖与核酸复合以形成双重衍生化的(DD)壳聚糖核酸多聚物。22.如权利要求21所述的组合物，其中所述核酸是DNA或RNA。23.如权利要求21所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的胺与磷酸根的比率为2至100。24.如权利要求23所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的胺与磷酸根的比率为2至50。25.如权利要求24所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的胺与磷酸根的比率为2至30。26.如权利要求25所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的胺与磷酸根的比率为2至15。27.如权利要求21所述的组合物，其中所述多聚物包含在官能化前平均分子量小于15kDa的壳聚糖。28.如权利要求27所述的组合物，其中所述多聚物包含在官能化前平均分子量小于10kDa的壳聚糖。29.如权利要求28所述的组合物，其中所述多聚物包含在官能化前平均分子量小于5kDa的壳聚糖。30.如权利要求21所述的组合物，其中所述组合物具有3.0-8.0的pH。31.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物具有4.0-7.0的pH。32.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物具有4.5-6.5的pH。33.如权利要求22所述的组合物，其中所述RNA为反义RNA、siRNA、短发夹RNA、mRNA、微小RNA或酶促RNA。34.如权利要求21所述的组合物，其中所述核酸选自由锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏阿糖核酸(TNA)组成的组。35.如权利要求21所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的平均多分散指数(PDI)小于0.5。36.如权利要求35所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的平均多分散指数(PDI)小于0.4。37.如权利要求36所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的平均多分散指数(PDI)小于0.3。38.如权利要求37所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物的平均多分散指数(PDI)小于0.25。39.如权利要求21所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物包含在官能化之前平均分子量小于50kDa、平均小于310个葡糖胺单体单元、N/P比率为2至20、平均流体力学直径小于500nm、在酸性pH下平均ζ电势为至少0mV、多分散指数(PDI)小于0.5并且核酸浓度大于0.5mg/ml的壳聚糖分子，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物基本上不含沉淀的多聚物，并且所述DD-壳聚糖核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少6小时内它们的平均直径增加小于100％。40.如权利要求39所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少12小时内它们的平均直径增加小于100％。41.如权利要求40所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少24小时内它们的平均直径增加小于100％。42.如权利要求41所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物是尺寸稳定的，因为在室温下在至少48小时内它们的平均直径增加小于100％。43.如权利要求21所述的组合物，其中所述DD-壳聚糖核酸多聚物包含在官能化之前平均分子量小于65kDa、平均小于400个葡糖胺单体单元、N/P比率为2至20、平均流体力学直径小于500nm、在酸性pH下平均ζ电势为+1至+40mV、多分散指数(PDI)小于0....

【专利技术属性】
技术研发人员：高峻，艾瑞克·粟，安东尼·钟，
申请(专利权)人：恩根尼公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA