利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，该方法步骤如下：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱‑20℃保存备用。(2)蜜蜂基因组DNA提取：取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA，进行DNA浓度和纯度测定。(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物为：F：5’‑TGATAAAAGAAATATTTTGA‑3’，R：5’‑GAATCTAATTAATAAAAAA‑3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积。本发明专利技术的有益效果为：利用线粒体DNA分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定，操作简单，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于畜牧品种鉴定
，具体涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法。
技术介绍
我国是世界第一养蜂大国，更是世界蜂王浆的主要生产国和出口国，蜂王浆产量和出口量均占世界90％以上。中国蜂王浆产量居世界首位很大程度上归功于20世纪80年代我国培育成功的王浆高产蜂种—浙江浆蜂。浙江浆蜂已被列入国家畜禽遗传资源目录。目前浙江浆蜂已推广至除西藏外的全国各地，在我国蜂种市场占有重要地位，在我国蜂王浆生产中发挥着重要作用。目前蜂种鉴定的主要方法还是形态学测定，费时费力，误差较大，尤其是亲缘关系相近的蜂种很难从形态上快速鉴别。目前还没有用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效方法，严重影响了浙江浆蜂种蜂业的健康发展，迫切需要用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效的技术手段。线粒体DNA是动物细胞核外唯一的遗传物质，具有结构简单、进化速度快、母系遗传和基因重组率小等特点。此外，由于蜜蜂特殊的生殖机制，一个蜂群中所有的工蜂都拥有与蜂王相同的线粒体DNA，一只工蜂就可代表蜂王和整个蜂群，这就大大减少了工作量，使其成为研究蜜蜂分类和品种鉴定的一种重要的遗传标记。NADH脱氢酶第二亚基(NADHdehydrogenasesubunit2，ND2)是线粒体电子传递链复合体的组分之一。很多研究表明,与线粒体其他蛋白质编码基因和rRNA基因相比，ND2基因具有更快的进化速率。许多学者已经将ND2基因序列应用于动物分类研究并显示出其良好的分子标记特性。因此，申请人开展了蜂线粒体ND2基因序列的克隆、多态位点筛查及其用于浙江浆蜂品种鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，本专利技术目的在于筛选与浙江浆蜂品种相关的分子标记，应用该分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的。这种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，该方法步骤如下：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱-20℃保存备用。(2)蜜蜂基因组DNA提取：取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA，进行DNA浓度和纯度测定。(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物为：F：5’-TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，42℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃后延伸10min。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后进行测序。(4)鉴定浙江浆蜂蜂群：将步骤(3)的测序结果使用DNAStar软件进行序列查看和校正，根据等位基因鉴定浙江浆蜂蜂群。当等位基因为A时，此蜂群为浙江浆蜂。(5)为使测定结果尽可能准确可靠，可以重新取样1次进行重复。待鉴定蜂群为纯种蜂群，如果是杂交蜂群，该方法只能鉴定其母亲是否来源于浙江浆蜂。本专利技术利用线粒体DNA等位基因鉴定浙江浆蜂品种是通过严格筛选的。采集浙江浆蜂主要分布区的样本和其它国内主要饲养的西方蜜蜂品种样本，提取基因组DNA，PCR扩增和测序线粒体DNA基因序列，通过品种间比对分析最终筛选出线粒体ND2基因序列的等位基因A作为浙江浆蜂品种的分子标记。本专利技术的有益效果为：利用线粒体DNA分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定，操作简单，可靠性强，稳定性好，成本较低。附图说明图1为浙江浆蜂品种鉴定的等位基因参考峰图1。图2为浙江浆蜂品种鉴定的等位基因参考峰图2。图1中方框标注的等位基因A主要存在于浙江浆蜂。图2中方框标注的等位基因G主要存在于原意、美意、澳意、本意以及卡蜂等蜜蜂品种。具体实施方式下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1：采用本方法鉴定浙江浆蜂1.材料、试剂和仪器(1)试验材料：平湖、萧山、长兴地区的浙江浆蜂样本随机取各30群；从“国家级蜜蜂种质资源保护场”采集原意蜜蜂10群、本意蜜蜂10群、澳意蜜蜂5群、美意蜜蜂5群，以及卡尼鄂拉蜂品种20群。(2)主要试剂：蛋白酶K(20mg/mL)(北京百泰克生物技术有限公司)；TaqDNA聚合酶(5U/μL)、10×Buffer(含Mg2+)，2.5mMdNTP、DNAMarker(DL2000)(大连宝生物公司)；琼脂糖(西班牙BiowestAgarose)。(3)主要仪器：DNA定量仪(美国ThermoScientific)、PCR仪(德国Biometra)、电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)。2.检测方法(1)蜜蜂基因组DNA提取取各个品种每个蜂群中封盖期蜜蜂工蜂个体1只，剪取头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA。具体方法如下：破碎后组织加入1mL的灭菌水，颠倒混匀，10,000转离心10min，弃上清，管底应该有沉淀，重复两次；加入200μL的DNA裂解液，5μL的蛋白酶K混匀；55℃过夜消化；消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液(1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色；12000转离心10min；取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体；加入等体积的氯仿，颠倒混匀；12000转离心10min；取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体；加入1/10体积的醋酸钠以及2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀；12000转离心10min；弃上清；加入1mL70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次；12000转离心10min；弃上清，然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净；加入灭菌水溶解DNA，一般加入50μL灭菌水溶解。使用DNA定量仪进行DNA浓度和纯度测定。(2)PCR扩增合成引物：F：5’-TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱‑20℃保存备用；(2)蜜蜂基因组DNA提取：剪取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，使用酚仿抽提法提取DNA；(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物为：F：5’‑TGATAAAAGAAATATTTTGA‑3’，R：5’‑GAATCTAATTAATAAAAAA‑3’；PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，42℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃后延伸10min；将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后进行测序；(4)鉴定浙江浆蜂蜂群：将步骤(3)的测序结果使用DNAStar软件进行序列查看和校正，根据等位基因鉴定浙江浆蜂蜂群，当等位基因为A时，此蜂群为浙江浆蜂。...

【技术特征摘要】
1.一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱-
20℃保存备用；
(2)蜜蜂基因组DNA提取：剪取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，使用酚仿抽提
法提取DNA；
(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物为：F：5’-
TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’；PCR反应体系为：总体积20μL，
10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM引物F和R各0...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹联飞，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33