利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法技术

本发明专利技术属于果树栽培和植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法。本发明专利技术公开了一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液、生长培养基和恢复培养基。所述步骤为：1)从健康扁桃植株上剥取含1‑2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入预处理液中预培养1d；2)室温下用装载液装载20min，0℃下用玻璃化液处理70min，再加入少量新鲜玻璃化液后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；3)40℃水浴锅中化冻2～3min，用洗涤液卸载30min，吸干洗涤液后转至恢复培养基24℃暗培养7d后转光照下培养。本发明专利技术的成活率可达61.01％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于果树栽培和植物组织培养
，具体涉及一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法。
技术介绍
扁桃(AmygdaluscommunisL.)属蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)桃属(Amygdalus)扁桃亚属(Subg.Amygdalus)植物，俗称巴旦杏，其种仁具有很高的营养价值和经济价值，深受广大人民的喜爱，为世界四大干果之一，起源于中亚细亚，约6000年的栽培历史，大面积栽培始于19世纪后期。目前扁桃的引种栽培遍及美国、西班牙、希腊、意大利、土耳其等32个国家和地区，其中美国的栽培面积及产量均居世界之首。扁桃品种极其丰富，据报道，全世界有扁桃品种4000余个，我国自行培育和引进的品种有200多个，其中新疆约有90多个。主要集中在中国新疆南疆的喀什、疏勒、疏附、英吉沙、叶城、泽普及和田等地，栽培面积约为10000hm2。目前，由于自然因素和人为活动的影响，扁桃呈现品种混杂、抗逆性差，甚至部分品种面临遗失的危险。超低温保存一般是在液氮(-196℃)条件下保存植物细胞、组织或器官，使植物种质的新陈代谢活动基本停止，无限期地保持种质的遗传稳定性，对种质资源长期保存发挥重要作用。玻璃化超低温保存可以节省空间，避免继代、病虫害和气候等因素造成的种质丢失，并且设备简单，操作简便，是一种植物细胞和组织长期稳定保存的理想方法。目前该方法已经成功地应用于菠萝、苹果、马铃薯、草莓、刺梨等园艺植物的茎尖玻璃化超低温保存上，在柿和麻花秦艽等植物的休眠芽上也取得了较好的保存效果。迄今为止，尚未见到利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，所述的方法具有简单、快速和有效保存扁桃植物种质资源的特点，通过本专利技术的实施，使扁桃休眠芽的成活率达到61.01％以上。本专利技术通过下列技术方案实现：一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；恢复培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；按照以下步骤：(1)从健康扁桃植株上剥取含有1-2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入所述的预处理液中预培养1d；(2)在室温下用所述的装载培养液装载20min，于0℃下用玻璃化液PVS2处理70min，加入少量新鲜的玻璃化液PVS2后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；(3)在40℃水浴锅中化冻2～3min，用所述的洗涤液卸载30min，无菌纸吸干洗涤液后转至恢复培养基(MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，PH值为5.8)中，于24℃条件下暗培养7d后进行正常光照下培养(光照强度为3000lx)。2周后检查成活率，经实施成活率达到61.01％。本专利技术的方法可用于离体保存扁桃休眠芽。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点：本专利技术的材料选自扁桃休眠芽，不需进行低温锻炼，简化了操作步骤，直接预培养后，装载培养液装载20min，用玻璃化液PVS2处理70min，超低温冷冻保存。本专利技术的方法所用材料来源于新疆扁桃品种，操作简单、有效，不需特殊仪器和繁琐的处理工序，超低温保存后扁桃恢复生长良好，成活率可达61.01％，是一种可靠的方法。附图说明图1：预培养时间及浓度对离体休眠芽成活率的影响柱形图。附图标记说明：图中各处理如下：预培养时间分1d、3d、5d，预处理液中的蔗糖的浓度分别为0mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L。图2：装载培养液不同处理时间对离体扁桃休眠芽活性的影响的柱形图。附图标记说明：图中处理：装载培养液液处理处理时间设定0min、10min、20min、30min、40min等不同时间。图3：装载培养液不同处理时间对离体扁桃休眠芽成活率的影响。附图标记说明：图中处理：扁桃休眠芽装载20min后，在0℃冰水混合物条件下用玻璃化液PVS2离体处理扁桃休眠芽的时间分别为0min、10min、30min、50min、70min、90min。图4：再生培养3d后的扁桃休眠芽开始萌动的直观图。图5：再生培养2周后的扁桃休眠芽变绿的直观图。图6：再生培养12周后的扁桃扁桃无菌苗的直观图。具体实施方式实施例1：通用实施例一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；其中：预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；恢复培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；说明：MS为植物组织培养领域常用培养基(1962年配方，MS或称MS基本培养基配制方法参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)。所述的操作步骤为：A.本专利技术在每年扁桃芽进入休眠期(11月至次年3月)进行，实施例1的试验于2014年11月-2015年3月在新疆塔里木大学园艺试验站内进行，采集已嫁接4年的“矮丰”(实施本专利技术不限于此品种)扁桃树冠外围的1年生枝条上的休眠芽。B.材料灭菌：将“矮丰”扁桃休眠芽放入烧杯加少量洗洁精，用流动自来水冲洗半小时后，蒸馏水冲洗2～3遍，75％酒精消毒20s，0.1％HgCl2溶液消毒7-8min，最本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，其特征在于：包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；生长培养基：MS，附加6‑BA 0.3mg/L，IAA 0.5mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；恢复培养基：MS，附加6‑BA 0.3mg/L，IAA1.0mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；按照以下步骤：(1)从健康扁桃植株上剥取含有1‑2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入所述的预处理液中预培养1d；(2)在室温下用所述的装载培养液装载20min，于0℃下用玻璃化液PVS2处理70min，加入少量新鲜的玻璃化液PVS2后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；(3)在40℃水浴锅中化冻2～3min，用所述的洗涤液卸载30min，无菌纸吸干洗涤液后转至恢复培养基中，于24℃下暗培养7d后转移至光照强度为3000lx的光照下培养。...

【技术特征摘要】
1.一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，其特征在于：包括配制预处理液、
装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；
预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定
容至1L；
生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
恢复培养基：MS，附加6...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜喜，于军，焦培培，陈加利，赵书珍，党艳青，徐冰冰，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65