辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法技术

本发明专利技术提供辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，步骤如下：（1）在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；（2）皂化：在辣椒叶片中加入质量浓度为15‑30%的KOH‑甲醇皂化液，于40‑80℃皂化20‑60min；（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮‑乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。本发明专利技术还提供类胡萝卜组分的高效液相色谱检测方法，能够将辣椒叶片中10种类胡萝卜素很好的分离，并且能够同时定量测定10种类胡萝卜素的含量。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及辣椒叶片中十种类胡萝卜素组分的提取及其反相高效液相色谱含量的定量检测方法。

技术介绍

辣椒(Capsicumannuum.L.)，茄科辣椒属一年生草本植物，我国在四百多年前就有栽培记录，目前栽培品种多达几十种，在全国范围内均有种植，也是北方地区冬春季节设施栽培的主要蔬菜品种，北方地区冬春季节设施栽培主要受到低温弱光的影响，进而影响辣椒产量以及品质，筛选出耐弱光性及耐低温弱光性强的辣椒品种能从根本上解决问题。
类胡萝卜素是广泛存在于自然界中的一类天然色素，结构和功能多种多样，类胡萝卜素特殊的结构赋予了它们十分特殊的性质，这些性质决定了它复杂的生物学功能。类胡萝卜素可以抑癌防衰，增强免疫；研究还表明，类胡萝卜素除了是植物进行光合作用的重要辅助色素外，还有保护光合机构免遭光破坏和抗氧化等功能。颉建明等研究表明，辣椒叶片中总类胡萝卜素的含量与品种耐弱光性及耐低温弱光性具有良好的相关关系，但是决定辣椒品种耐性的主要类胡萝卜素组分尚不明确。
八氢番茄红素(Phytoene)、番茄红素(Lycopene)、α-胡萝卜素(α-carotene)、叶黄素(Lutein)、环氧叶黄素(Luteinepoxide)、β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)、单环氧玉米黄素(Antheraxanthin)、新黄质(Neoxanthin)、紫黄质(Violaxanthin)等是植物体内重要的光合色素，探明决定辣椒品种耐弱光性及耐低温弱光性的主要类胡萝卜素组分，既可通过分子生物学和基因工程，从分子水平上阐明辣椒品种的耐性机理，又可为筛选耐低温弱光性品种和种质资源提供依据，对今后辣椒育种具有重大的指导意义。
现有技术中，以石油醚为提取溶剂、皂化温度为80℃、皂化时间为40min、皂化液质量浓度为20%、皂化液体积为10mL、料液比为1：5，能够分离辣椒叶片中叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素；现有技术中还建立了以10mL80%丙酮为提取溶剂，以6mL200g/L的KOH-甲醇溶液为皂化液，50℃皂化30min为皂化条件的提取工艺；以C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为A乙腈，B乙酸乙酯，C水，波长440nm，流速1mL/min，柱温35℃为色谱检测条件的高效液相色谱检测方法；但是这些关键技术不能用于多种类胡萝卜组份的同时分离，也不利于分离后的检测。现有技术中能够建立同时分离多种类胡萝卜素组分及其含量测定方法的报道较少。现有技术中提供了小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法，该方法能够将小麦中的叶黄素与玉米黄质彻底分开，但是该方法仅限于对叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素，4种类胡萝卜素含量的提取与测定；现有技术中还提供一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，利用了超高效液相色谱法同时对草莓果实中叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素4种类胡萝卜素含量测定，但是局限性强。目前利用反相高效液相色谱法测定类胡萝卜素的研究还很少，现有的研究中没有一种方法适用于所有的试材，而辣椒叶片中多种类胡萝卜素组分分离及其含量测定方法目前文献报道尚未见到，更没有统一的行业测定标准。因此，建立一种能够同时分离辣椒叶片中多种类胡萝卜素，以及类胡萝卜素多种组分含量进行测定，从而为辣椒品种耐性的研究提供一种检测方法，具有重要意义。

技术实现思路

本专利技术提供了辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法，能够对辣椒叶片中十种类胡萝卜素同时进行提取，应用反相高效液相色谱法能够将辣椒叶片中十种类胡萝卜素组分很好的分离及含量定量测定。
本专利技术提供辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，步骤如下：
（1）液氮研磨：在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；作为优选，在研磨前还加入抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚；
（2）将辣椒叶片皂化：在步骤（1）加入质量浓度为15-30%的KOH-甲醇皂化液，于40-80℃皂化20-60min；作为优选，所述KOH-甲醇皂化液的质量浓度为20%；
（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮-乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:(2-8)ml；所述混合提取溶剂中丙酮与乙酸乙酯的体积比为1:2；
（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。
作为优选，步骤（2）中所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：（2-6）ml。
作为进一步优选，所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值优选为1g：4ml。
作为优选，步骤（2）中所述皂化条件为：55℃皂化30min。
作为优选，步骤（3）中所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:8ml。
作为优选，步骤（3）中所述超声提取的时间为10-50min，超声温度为30℃。
作为优选，所述超声提取的时间为40min。
作为优选，步骤（4）中所述后处理为将类胡萝卜素粗提液4℃下离心15min，取上清液，将上清液45℃旋转蒸发浓缩至近干。
上述各优选条件均是为了得到辣椒叶片中类胡萝卜素提取的最优条件，利于进一步提高纯度和提取率。
本专利技术还提供辣椒叶片中类胡萝卜素含量的定量检测方法，步骤如下：
（1）应用权利要求1-7任一所述的方法提取辣椒叶片中类胡萝卜素；
（2）用丙酮将得到的含有类胡萝卜素的溶液定容至10mL，过0.22μm有机滤膜，得到辣椒叶片类胡萝卜素待测样品；所述丙酮为色谱纯；
（3）依据下述色谱条件对待测样品进行高效液相色谱测试：色谱柱为WelchUltimateC30高效液相色谱柱，规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm；流动相的柱流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为450nm；
流动相组分为：A：乙腈，B：水，C：甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，其中，甲基叔丁基醚与甲醇体积比为1:1，D：乙酸乙酯；
流动相梯度洗脱程序为：0min～6min：B由0线性增加到10%，C保持0，D由0线性增加到10%；6min～12min：B由10%线性增加到15%，C保持0，D由10%线性增加到20%；12min～20min：B由15%线性递减到0，C保持0，D由20%线性递减到10%；20min～22min：B由0线性增加到5%，C由0线性增加到40%，D由10%线性递减到5%；22min～30min：B由5%线性递减到0，C由40%线性增加到50%，D由5%线性增加到20%；30min～35min：A线性增加到100%；
（4）根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定辣椒叶片类胡萝卜素待测样品中10种类胡萝卜素的保留时间，进一步确定各种类胡萝卜素组分的峰面积，将各种类胡萝卜素组分的峰面积分别代入相应的线性回归方程中，得到辣椒叶片中相应组分的类胡萝卜素的含量。
作为优选，所述单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间分别为：八氢番茄红素保留时间33.168min、番茄红素保留时间29.231min、α-胡萝卜素保留时间34.971min、叶黄素保留时间19.183min、环氧叶黄素保留时间25.026min、β-胡本文档来自技高网...

【技术保护点】
辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，其特征在于：步骤如下：（1）液氮研磨：在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；作为优选，在研磨前还加入抗氧化剂2,6‑二叔丁基对甲酚；（2）皂化：在（1）中加入质量浓度为15‑30%的KOH‑甲醇皂化液，于40‑80℃皂化20‑60min；作为优选，所述KOH‑甲醇皂化液的质量浓度为20%；（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮‑乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:(2‑8)ml；所述混合提取溶剂中丙酮与乙酸乙酯的体积比为1:2；（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。

【技术特征摘要】
1.辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，其特征在于：步骤如下：
（1）液氮研磨：在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；作为优选，在研磨前还加入抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚；
（2）皂化：在（1）中加入质量浓度为15-30%的KOH-甲醇皂化液，于40-80℃皂化20-60min；作为优选，所述KOH-甲醇皂化液的质量浓度为20%；
（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮-乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:(2-8)ml；所述混合提取溶剂中丙酮与乙酸乙酯的体积比为1:2；
（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：（2-6）ml；
作为优选，所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：4ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述皂化条件为：55℃皂化30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:8ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述超声提取的时间为10-50min，超声温度为30℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述超声提取的时间为40min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述后处理为将类胡萝卜素粗提液4℃下离心15min，取上清液，将上清液45℃旋转蒸发浓缩至近干。
8.辣椒叶片中类胡萝卜素含量的定量检测方法，其特征在于：步骤如下：
（1）应用权利要求1-7任一所述的方法提取辣椒叶片中类胡萝卜素；
（2）用丙酮将得到的含有类胡萝卜素的溶液定容至10mL，过0.22μm有机滤膜，得到辣椒叶片类胡萝卜素待测样品；所述丙酮为色谱纯；
（3）依据下述色谱条件对待测样品进行高效液相色谱测试：色谱柱为WelchUltimateC30高效液相色谱柱，规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm；流动相的柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：颉建明，郁继华，吕剑，李静，李杰，王小龙，胡玉琴，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62