鞋式导管在体局部导入基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种用鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，其特点为定位准确、直接导向心血管靶点、简易、无毒副作用，且可用于临床，该鞋式导管局部导入靶点的药物浓度，在一定范围内呈压力依赖性，且药物可在局部高浓度持续存在至少２４小时，在体局部导入的基因药物可抑制体内某些基因的表达，达到防治心血管疾病的作用。如用鞋式导管向损伤的髂动脉壁内定和导入的ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸可抑制动脉血管壁损伤后ｃ－ｍｙｃ原癌基因的超常表达，抑制血管平滑肌细胞增生和血管狭窄。该鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，将基因治疗疾病从动物实验走向临床应用的重要手段。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学分子生物学技术，涉及一种基因导入的方法，特别涉及一种。
技术介绍
如何将目的基因药物定位导入活体动物心血管等靶点部位，从而达到抑制某些基因的表达，这是使用基因药物防治心血管疾病的关键步骤。虽然目前逆转录病毒、腺病毒、病毒脂质体等基因转移方法，在动物实验中取得可喜的效果，但由于存在许多不可预料的毒副作用，用于在体导入基因受到很大限制，很难用于临床，直接外膜在体导入基因药物，虽然动物实验可行，但很难用于临床。用球囊导管向血管局部直接导入目的基因是一种定向、直接、简易、毒副作用小，且更为实用的方法，但目前这方面的研究鲜见报导，有待进一步研究。鞋式导管是最近研究生产的一种局部给药导管，已开始用于临床局部给药，该导管的特点是有两个不同的压力通道，可分别进行血管成形和给药，经外鞘可送入任何型号的标准血管成形导管，球囊扩张和给药可一次完成。该导管是否可成为局部导入基因药物的工具目前仍未见报导。如何用此导管导入基因？方法如何？能否达到抑制体内基因的表达等，尚不清楚。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是，至少包括以下步骤第一步采用鞋式导管，先经鞘管内腔送入标准血管成形导管，在靶点血管处，球囊成形后，松球囊，然后将外鞘尖端给药区和PTCA球囊导管一起送至球囊血管成形处，再打起PTCA球囊导管(1.5atm)后，经三通联接管用压力泵经外鞘局部给药于损伤处血管壁；经血管局部导入同位素锝99测定血管局部浓度，评价局部给药的可行性；第二步经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸1)寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人的c-myc基因第二外显子中(从4521到4536)的15个核苷酸；c-myc正义核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反义核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸盐修饰核苷酸，PAGE纯度(摩尔比)99％；2)用苯巴比妥耳缘静脉麻醉(30mg/kg)，常规消毒后，先分离、暴露活体物的右股动脉，作一小切口后，经股动脉放入带有标准血管成形导管(球囊直径3.0mm)的鞋式导管，将导管送至腹主动脉中、下端时，通过压力泵使标准血管成形导管的球囊充盈(6atm)后，强行将其缓慢回撤至切口处，如此反复进行3次；每次30-60秒，造成血管壁内膜损伤，然后松球囊，使之退入鞋式导管鞘内，连同鞋式导管的尖端一并送至髂动脉处，打起球囊(1.5ml)，经鞘管尖端导入c-myc反义寡核苷酸426umol/L(0.5ml)后，经三通开关给生理盐水1.5ml，给药时间＜30秒，所用压力为5atm，给药后局部做标记，从切口处结扎股动脉，外科缝合，关闭切口；3)经鞋式导管局部导入基因药物c-myc反义寡核苷酸观察在体表达效应评价是否能导入基因药物，导入基因药物是否在体表达。本专利技术的鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，其定位准确、直接导向心血管靶点、简易、无毒副作用，且可用于临床，该鞋式导管局部导入靶点的药物浓度，在一定范围内呈压力依赖性，且药物可在局部高浓度持续存在至少24小时，在体局部导入的基因药物可抑制体内某些基因的表达，达到防治心血管疾病的作用。采用鞋式导管向损伤的髂动脉壁内定和导入的c-myc反义寡核苷酸可抑制动脉血管壁损伤后c-myc原癌基因的超常表达，抑制血管平滑肌细胞增生和血管狭窄。该鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，将基因治疗疾病从动物实验走向临床应用的重要手段。附图说明图10是为HE染色显微镜下的图片；其中A.正常兔髂动脉内膜由内皮细胞和内弹力板构成，内无增生；B.球囊损伤后内膜增生的髂动脉，内皮剥脱、VSMC和细胞外基质增生，共同构成新生内膜(NI)；C.球囊损伤后导入c-myc反义寡核苷酸的髂动脉，可见内膜增厚程度明显低于未给药段血管(图B)；图11是兔髂动脉球囊损伤后40天，Vethoeff弹力纤维染色显微镜下的图片；其中A为损伤未给药的对照段血管，B为导入c-myc反义寡核苷酸的动脉血管段；二者比较管腔面积(见图A1、B1)内膜增生厚度(见图A2与B2)均有显著差异，图的放大倍数为4倍(图A1、B1)和8倍(图A2、B2)。图12是球囊损伤兔髂动脉后1周，c-myc蛋白免疫组化染色强阳性图片；阳性颗粒定位于VSMC细胞核内。图13是术后2周，球囊损伤兔髂动脉段血管c-myc蛋白免疫组化染色阳性图片；其中(a)阳性图片，而给药段血管呈阴性(b)，放大倍数为40倍。图14是球囊损伤兔髂动脉后40天的显微镜下的图片；其中图A为c-myc蛋白免疫组化染色阳性，图B为而经鞋式导管导入c-myc反义寡核苷酸的动脉血管段呈阴性，放大倍数为40倍。图15是兔正常髂动脉和球囊损伤兔髂动脉3天电镜观察结果图；其中A.是兔正常髂动脉显示，VSMC内充满大量成束肌丝，只在核周围有少量粗面内质网，游离核体及线粒体致密体和致密斑清晰可见，此为典型的收缩型VSMC；图B、C、D为球囊损伤兔髂动脉3天观察结果，图C所示中层VSMC穿越内弹力膜小窗，向内膜迁移；图B显示收缩型VSMC向分泌型，VSMC过渡，胞浆中仍可见少量肌丝和密体，但已可见大量游离核糖体和粗面内质网；图D显示的未见致密斑及密体，但高尔基体十分发达，粗面内质网、游离核糖体及线粒体非常丰富，呈典型状的分泌型VSMC。图16是6atm组TMII在不同组织中的分布及随时间的变化图(占1ml TMII给药量的百分比值)；图17是两组靶点/血液放射性计数比值的比较图；图18是两组靶点/远端血管放射性计数比值的比较图；图19是两组靶点血管/1ml TMII放射性计数比值的比较图；图20是球囊损伤2周后增生内膜面积比较图；图21是球囊损伤2周内膜平均厚度比较图；图22是球囊损伤2周后内膜/中膜面积比较图；图23是球囊损伤2周最大内膜厚度比较图；图24是球囊损伤40天内膜面积比较图；图25是球囊损伤40天内膜/中膜面积比较图； 图26是球囊损伤40天最大内膜厚度比较图；图27是球囊损伤40天平均内膜厚度比较图；图28是球囊损伤后内膜平均厚度的变化图；图29是球囊损伤后内膜/中膜面积的变化图；图30是6atm组TMII在不同组织中的分布图。取材和测量术后30min处死9只动物、6h处死两只、24h处死两只。分别取靶点血管(腹主动脉下端)、心、肝、肺、骨髂肌、小肠、血液、非靶点血管(腹主动脉下端)、心、肝、肺、骨骼肌、小肠、血液、非靶点血管(肺动脉)组织，分别将其用生理盐水冲洗并称其重量，并用γ计数仪计数，同时对体外1ml TMII用γ计数仪计数。经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸。1)寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人的c-myc基因第二外显子中(从4521到4536)的15个核苷酸。由上海生工生物工程有限公司——加拿大SANGON上海分公司合成。c-myc正义核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反义核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸盐修饰核苷酸，PAGE纯度(摩尔比)99％。2)动物模型的建立和经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸取21只家兔，体重2.5kg-3.5kg，雌雄各半，对照组6只，反义寡核苷酸组15只。再按观察时间不同分为3天、7天、14天和40天5个观察组，其中40天给药组和对照组各为6只本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鞋式导管在体局部导入基因的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：第一步：采用鞋式导管，先经鞘管内腔送入标准血管成形导管，在靶点血管处，球囊成形后，松球囊，然后将外鞘尖端给药区和ＰＴＣＡ球囊导管一起送至球囊血管成形处，再打起ＰＴＣＡ球囊 导管（１．５ａｔｍ）后，经三通联接管用压力泵经外鞘局部给药于损伤处血管壁；经血管局部导入同位素锝↑［９９］测定血管局部浓度，评价局部给药的可行性；第二步：经鞋式导管在体导入ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸１）寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人 的ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子中（从４５２１到４５３６）的１５个核苷酸；ｃ－ｍｙｃ正义核苷酸：５’ＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴｃ－ｍｙｃ反义核苷酸：３’ＴＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＡ用硫代磷酸盐修饰核苷酸，ＰＡＧＥ纯度（摩尔比）９ ９％；２）用苯巴比妥耳缘静脉麻醉（３０ｍｇ／ｋｇ），常规消毒后，先分离、暴露活体物的右股动脉，作一小切口后，经股动脉放入带有标准血管成形导管（球囊直径３．０ｍｍ）的鞋式导管，将导管送至腹主动脉中、下端时，通过压力泵使标准血管成形导管的球 囊充盈（６ａｔｍ）后，强行将其缓慢回撤至切口处，如此反复进行３次；每次３０ｓ－６０ｓ，造成血管壁内膜损伤，然后松球囊，使之退入鞋式导管鞘内，连同鞋式导管的尖端一并送至髂动脉处，打起球囊（１．５ｍｌ），经鞘管尖端导入ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸４２６ｕｍｏｌ／Ｌ０．５ｍｌ后，经三通开关给生理盐水１．５ｍｌ，给药时间＜３０秒，所用压力为５ａｔｍ，给药后局部做标记，从切口处结扎股动脉，外科缝合，关闭切口；３）经鞋式导管局部导入基因药物ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸观察在体表达效应，评价是否能 导入基因药物，导入基因药物是否在体表达。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：兰燕平，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]