一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，包括以下步骤：(1)收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，提取总DNA；或者从芦荟食品中提取芦荟凝胶总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用SEQ ID NO:2和3所示引物进行PCR扩增反应，扩增ITS序列；(3)PCR产物进行直接测序；(4)利用MEGA4.1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树，根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦荟品种。其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNA ITS序，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的方法操作简单易行，可达到方便、快速、客观、准确区分库拉索芦荟与其他芦荟品种的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及一种鉴定芦苔品种的方法，特别设及一种利用ITS序列鉴定库拉索芦 苔品种的方法，属于植物种质资源的鉴定

技术介绍
芦苔（Aloe)是一种长绿多肉质草本植物，隶属于多年生单子叶植物纲 (Monoctyledoneae)天口冬目（Asparagales)独尾草科（Asphodelaceae)。该科W前的分 类法中大部分属分在百合科化iliaceae)内，被列为亚科。芦苔属（Aloe L.)为1754年瑞 典分类学大师林奈的建立的，发表在他的经典著作《植物属志》第五版。1980年出版的《中 国植物志》14卷（百合科），将芦苔属隶属于广义的百合科中。百合科有230个属，3500个 种，本属内有300余种。 芦苔的用途很广，它的有效成分对人体有特殊保健功能和抗肿瘤的作用，目前已 广泛应用于保健品、化妆品、食品、观赏和药物工业上。芦苔属（Aloe L.)植物种类繁多，变 异多样，种质资源异常丰富，传统的芦苔种分类主要依据是形态学、细胞学。根据形态学进 行分类比较直观。但由于芦苔和近缘属间杂交可育，不断出现一些新的属间杂交种；且芦苔 属内同名异种和异名同种现象多有发生，造成不同种或亚种间的亲缘关系比较混乱，形态 学有时难W反映种间的遗传差异和亲缘关系。而有关其种间亲缘关系的研究资料甚少。目 前在我国确认能用于食品的只有库拉索芦苔运一品种，因此从分子水平对芦苔种分类、鉴 定和确定亲缘关系的研究具有十分重要的意义。 DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术，已经成功用于生 物物种分类和鉴定、生态学调查和生物多样性评估等研究领域，为植物遗传多样性检测提 供了更直接、更精确的方法，即直接检测DNA本身的序列变化。由于避免了根据表型性来推 断基因型时可能产生的各种问题，DNA分析方法成为了目前为止最有效的遗传学分析方法， ITS序列是中度重复序列，广泛分布于基因组并且是同步进化，它的碱基序列同源性的程度 决定生物之间的亲缘关系远近。同时它存在于细胞核中，避免了其他DNA条形码基因存在 于叶绿体中，而在芦苔凝胶中含量极低的问题。因此本专利技术专利将dm条形码技术应用于 鉴别芦苔品种，通过扩增ITS序列和对其进行分析，从分子水平探讨它们之间的亲缘关系， 建立了在分子水平检测食品中芦苔真伪及是否为库拉索芦苔的方法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对目前存在的芦苔原料真伪及品种问题，提供一种鉴别芦 苔材料真伪及其是否为库拉索芦苔的核巧酸序列及方法，从DNA水平上分析芦苔种植资源 的遗传特征，为鉴定库拉索芦苔提供有效的分子标记。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是： -种利用ITS序列鉴定库拉索芦苔品种的方法，其特征在于，包括W下步骤： (1)收集健康新鲜芦苔样品的成熟叶片，提取总DNA ;或者从芦苔食品中提取芦苔 凝胶总DM ; Ο) W步骤（1)中提取的DM为模板，使用SEQ ID NO: 2和3所示引物进行PCR扩 增反应，扩增ITS序列； (3) PCR产物进行直接测序； (4)利用MEGA 4. 1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树， 根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦苔品种。 其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦苔的rDNA ITS序列，是位于18S和26SrRNA 之间的DM序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 在本专利技术中，优选的，收集健康新鲜芦苔样品的成熟叶片，进行切割处理后置于柔 软且透气性较好的纸袋，并放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥；或者收集健康新鲜芦苔样 品的成熟叶片，进行切割处理后放入一次性培养皿中，用保鲜膜封好，-20°C冷冻至芦苔叶 片冷冻完全，随后放入冻干机中冷冻干燥2地，后放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥。 在本专利技术中，优选的，所述的硅胶是粉末状的直径为20~30A的白色硅胶与蓝色 变色硅胶的混合物。[001引在本专利技术中，优选的，所述的PCR扩增反应的反应体W 25 μ L计为： lOxPC艮反应缓冲液 2 5|uL lOmMdHTP 2 μ L 1 Onmol/ μ L SEQ ID NO:2 所示引物 I μ L ]Onmol,'' μ L ISEQ iD NO:3 所示引物 I μ L ].75U Taq 聚合酶 0.2 μ L DNA模板 2 μ L 加 H2O 16.3 μ L.. 在本专利技术中，优选的，其特征在于，所述的PCR扩增反应的反应条件为：94°C预变 性 4min，94°C变性 40s，52°C复性 40s，72°C延伸 2min，30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin，4°C 保存。 本专利技术还提供了一种ITS序列在鉴定库拉索芦苔品种中的应用，所述的ITS序列 来源于库拉索芦苔的rDNA ITS序列，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核巧酸序 列如沈Q ID NO: 1所示。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在： 本专利技术提供的来源于库拉索芦苔的rDNA ITS序列，可用作对照鉴别库拉索芦苔原 料；通过在DNA水平上分析库拉索芦苔的遗传特征，为区分库拉索芦苔、木立芦苔、开普芦 苔等提供了有效的分子标记，为库拉索芦苔的品种真伪鉴定W及筛选优良品种等奠定了基 础。 同时，本专利技术提供的利用上述ITS序列鉴别库拉索芦苔品种的方法，操作简单易 行，可达到方便、快速、客观、准确区分库拉索芦苔与其他芦苔品种的目的。【附图说明】 图1为4个品种芦苔基因组DM电泳图谱；其中，Μ为DM Marker, 1为库拉索芦 苔样品，2为开普芦苔样品，3为木立芦苔样品，4为芦苔酱样品； 图2为4个芦苔样品材料DNA的PCR扩增产物电泳图谱；其中，Μ为DNA Marker, 1为库拉索芦苔样品，2为开普芦苔样品，3为木立芦苔样品，4为芦苔酱样品；图3为不同品种芦苔材料ITS序列聚类分析结果图； 图4为不同产地库拉索芦苔材料ITS序列聚类分析结果图。【具体实施方式】 下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但运些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可W对本专利技术技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但运些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实施例1 本实施例测定了来自3个不同品种的芦苔资源的核糖体DNA ITS序列，芦苔品种 包括库拉索芦苔、开普芦苔和木立芦苔，采用的方法包括如下步骤： (1)样品采集与处理 采用W下两种方法对样品进行处理： ①采集当年生的成熟的、健康的新鲜芦苔叶片作为提取基因组DNA的材料，进行 切割处理后置于柔软且透气性较好的纸袋，并放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥。透气的 纸袋可W将植物DNA材料在干燥时与硅胶分开，运样即便植物叶片因干燥变脆后，也不会 与硅胶混杂，并造成样品间的交叉污染。干燥用的硅胶是粉末状的白色硅胶（直径为20~ 30A)与变色硅胶（蓝色）的混合物。或者 ②选取健康的新鲜植物DNA材料，切割处理成小片，放入一次性培养皿中，用保鲜 膜封好，-20°C冷冻至芦苔叶片冷冻完全。随后放入冻干机中冷冻干燥2地。后同样要置于 干燥盒中进行干燥保存。此种方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，提取总DNA；或者从芦荟食品中提取芦荟凝胶总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用SEQ ID NO:2和3所示引物进行PCR扩增反应，扩增ITS序列；(3)PCR产物进行直接测序；(4)利用MEGA 4.1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树，根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦荟品种。其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNA ITS序列，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董银卯，李萌，王巧娥，孙明，安丽源，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京;11