一种提高金藻DHA含量的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高金藻DHA含量的培养方法。在金藻光自养培养过程中加入终浓度为0.5～8.0％(v/v)的甘油，提高藻细胞DHA占总脂肪酸的比例，藻细胞DHA量较未添加甘油组均有所提高，最高可提高45％以上。本方法简单易行，并且在添加甘油的培养体系的藻细胞内多不饱和脂肪酸的量也有很大提升。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物
，具体涉及金藻及金藻细胞DHA占总脂肪酸的比 例。
技术介绍
二十二碳六帰酸值OCOS址exaenoic acid,简称DHA)是一种重要的ω - 3型高碳 多不饱和脂肪酸，也是动物和人体不能合成而必须由食物提供的一种必需脂肪酸。是维持 大脑、视网膜等正常生长和功能发育的必需脂肪酸，还具有降血脂、抗血栓和抗动脉粥样硬 化等作用。 微藻中含有大量的DHA，且其它长链不饱和脂肪酸的含量较低，利于DHA的分离纯 化。由于微藻的培养受季节和地域的影响较小，借助于生物反应器可实现常年工亚化大规 模培养，而且微藻中的脂肪组成不像鱼油郝么复杂，使得微藻DHA的分离纯化工艺相对简 单，所得DHA产品无鱼腥味和其它异味，只有独特的海藻味，并无不良化学成分。利用海洋 微藻培养生产的DHA可做到不含ΕΡΑ和污染物，所W质量好，可W广泛使用于各类食品中。 尤其是可W用于鱼油来源DHA所不能用的领域（例如孕妇、哺乳期妇女和婴幼儿保健品和 食品）。目前，微藻来源的DHA产品在发达国家供不应求，价格也高于鱼油来源DHA。 W湛江等鞭金藻为例，湛江等鞭金藻是一种分布广泛的海洋浮游单细胞藻类 个体小，繁殖快，具无纤维素的细胞壁，营养丰富，尤其在藻体中富含多不饱和脂肪酸 (poly-unsaturated fatty acid, PUFAs)，是海洋中鱼、奸和贝类的等幼体生长发育过程中 必需的营养成分。此外，近年来的研究证明，n-3PUFAs还具有防治人类必血管疾病，促进婴 幼儿大脑发育和改善视力的功效。所W它作为一种优质的PUFAs海洋生物资源，有很好的 应用前景。因此，寻找一种提高藻细胞内DHA占总脂肪酸比例的培养方式是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于在限氮培养体系中添加辅助碳源甘油，提高金藻DHA占总脂肪 酸的比例的培养方法。 为了实现上述目的，本专利技术采用的培养方法包括W下步骤： 1)藻种培养于锥形瓶中，培养至指数生长期使用； 2)将指数生长期的藻细胞接种于灭菌的F/2培养基中，添加甘油培养至平台期收 获藻细胞； 3)脂肪酸成分分析；将收获的藻细胞烘干得藻粉，采用酸催化转醋化法，气质联 用方法对金藻脂肪酸成分进行测定（参考文献：冯迪娜，艾江宁，刘亚男，等.含氮 类培养基对海洋微藻Isochrysis zhanjiangensis油脂与碳水化合物积累的影响.中 国生物工程杂志，2011，10:29-34.)。 培养参数： 1)氮限制培养是指接种时使用3x F/2培养基，即磯源、金属元素、微量元素各添 加常规F/2的3倍； 2)添加甘油的时间为接种时添加或指数生长期添加； 3)添加0. 5~8. 0% (v/v)的甘油，根据初始接入细胞浓度，按照8~16pg/ cell ( W硝酸钢计）的比例调整初始氮源浓度； 4)培养温度23~27。光强110~150 μ mol. m 2s 1，光暗比为1地；10h，通入含 4. 0% C〇2的空气，通气速率0. 1~0. 3vvm。 本专利技术的优点如下： 1、DHA含量明显高；本专利技术所得到的藻细胞DHA含量有显著提高，DHA含量最高位 16.0%，比未添加甘油培养体系的藻细胞提高45% W上。 2、应用前景好；本研究是在光自养培养金藻的过程中添加甘油。甘油是微藻生物 柴油生产的副产物，同时也是一种低值的化工原料，伴随生物柴油加工规模的增长，如何提 升甘油的附加值正逐渐受到人们的关注和重视。本研究利用海水培养微藻，缓解淡水资源 的危机。[001引附图表说明： 图1.金藻生长曲线图 A.接种时添加甘油培养体系金藻生长曲线； B.指数生长期添加甘油培养体系金藻生长曲线；【具体实施方式】 实施例1 ;培养过程生长阶段判定 每天用 Jasco V-530UV/VIS Spectrophotometer (JASC0, Tokyo, Japan)监测金 藻细胞数；利用OD法，在680nm处测定培养系统中的金藻吸光度，利用公式"细胞密度 (X104cells/mL) = (ODes〇X125〇-90. 125)X稀释倍数"计算出对应的细胞密度。绘制生长 曲线，W判定细胞生长至稳定期。不同培养条件下，金藻的生长曲线见图1。 实施例2营养盐及培养基配制 无娃酸盐的F/2营养盐母液配制：[002引 （1)氮源；称取75g NaN03溶于1L去离子水； 似磯源：称取5g胞&口〇4 · &0溶于1L去离子水； (3)金属元素：分别称取 3. 15g 化CI3 · 6&0, 4. 36g 胞2邸TA，0. 0098g CuS04·5H20,0.0063g化2Mo04·2H20,0.022gZnS04·7H20,0.01gCoCl2·細20,0.18g MnClz · 4&0溶于1L去离子水； (4)维生素；0.0 Olg vitamin Bi2, 0. 2g vitamin Bi, 0.0 Olg D-生物素，溶于 1L 去 离子水； F/2培养基的制备： 天然海水经莫氧杀菌，两层0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，ll(rC灭菌15min，冷却后 备用；向海水中添加上述（1)，（2)，（3)，（4)制得的无娃酸盐的F/2营养盐，其中氮源、磯源、 金属元素各1血/L，维生素0. 5血/L。 实验所用甘油：分析纯甘油与经0. 45 μ m醋酸纤维滤膜过滤的海水W体积比1 ;1 混匀，12rC灭菌20min后冷却，常温保存。[003引实施例3 ;金藻培养 采用实施例2中的F/2培养基，W等鞭金藻化zhangjiangensis)ODes。= 0. 1~ 0. 2、藻液体积约1. 5~2.化接种于化Η角瓶，用日光灯做光源，光强为30~40 μ mol. m 2s 1，培养3~5天至指数生长期；离必（3000~4000巧m，3~5min)，收获藻细胞，弃上 清液，沉淀中添加约3~5mL灭菌的海水，使之重新悬浮，加至F/2培养基中，W氮元素浓 度0. 8~1. 6X 10 Smg/cell ( W硝酸钢计）接种，其他营养成分（除氮源）添加浓度为3倍 实施例1所述F/2培养基，即磯源、金属元素、微量元素各添加常规F/2营养盐的3倍，调 至ODes。= 0. 28~0. 32, 500血藻液接种于600血管式鼓泡反应器，培养温度23~27°C，光 强110~150 μ mol. m2s 1，光暗比为1地；10h，光照阶段通入含4.0 % (?的空气，通气速率 0. 16~0. 24vvm，培养至7天（平台期），离必（4000巧m，5min)，弃上清液，沉淀用0. 5mol/L 的碳酸氨倭洗两遍，6(TC烘至恒重，冻干备用，采用气质联用方法对金藻脂肪酸成分进行测 定。 添加甘油： 添加甘油的浓度；500血培养体系，分别加入3血、8血、15血、50血、100血实施例2 中所述的甘油，对应培养体系甘油的最终浓度分别为0. 3% (v/v)、0. 8% (v/v)，1.5% (v/ v)、5. 0% (v/v)、10. 0% (v/v)。 添加甘油的时间；接种时（即反应器培养的第0天）添加甘油，指数生长期（反应 器培养的第3天）添加甘油。[003引接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高金藻DHA量的培养方法，其特征在于在金藻光自养培养过程中，通过在培养体系添加终体积含量为0.5‑8％(v/v)甘油，提高金藻DHA占总脂肪酸的比例。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛松，王茜，曹旭鹏，吴霜，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21