本发明专利技术提供了一种快速检测大肠杆菌O157：H7的检测方法。方案将Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球富集细菌，制备试纸条，上样检测。免去了将大肠杆菌O157：H7从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将Ru(bqy)32+纳米微球喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。检测方案灵敏度非常高、稳定性很好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体采用Fe304/RU(bqy)32+纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测大肠杆菌0157: H7。技术背景近年来，随着人民生活水平的提高，食品安全已经成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是构成食品安全的重大隐患，大肠杆菌0157:H7是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一，它的感染剂量非常低，最少10个活菌就可能感染致病。感染大肠杆菌0157:H7的临床症状包括腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征和血栓形成的血小板减少性紫癜等，从接触该菌到发病平均周期为3天，潜伏期短则I天，最长能达到8天以上。大肠杆菌0157:H7主要通过污染肉类，蔬菜和水果以及饮水等途径感染人类引发相应的食源性疾病，严重危害人体健康。目前检测大肠杆菌0157:H7的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；PCR方法、电化学方法以及生物传感器法对大肠杆菌0157:H7检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对大肠杆菌0157:H7的检测限通常不高于105CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为大肠杆菌0157:H7的检测提供简单、高效的途径。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种快速、灵敏、简便的大肠杆菌0157:H7定性、定量检测技术。本专利技术具体方案如下:一种快速检测大肠杆菌0157:H7的方法，包括以下步骤:I)纳米微球的制备:a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120°C，然后将3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反应2h ；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3?5次，得Fe3O4纳米粒子；b.取12mg Fe3O4纳米粒子用1-1OmL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子； c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL无水乙醇，1-1OmL去离子水和ImL 0.5_3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy )32+)混合，将混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600-900yL的NH40H，剧烈搅拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，用去离子水清洗备用；d.将ImL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80°C300rpm搅拌lh，离心得到娃烧化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球;e.将硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球；2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球加入ImL偶联缓冲液中，调节pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及100-500yg抗大肠杆菌0157:H7单抗，在温度37°C时，放在10_15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取ImL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-lh，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗；所述偶联缓冲液配制方法如下:将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；所述清洗缓冲液配制方法如下:称取0.43g 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；所述封闭剂配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；3)培养大肠杆菌 0157:H7，将菌液调整浓度为 106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取ImL备用；取待测样品溶液lmL、各浓度菌液lmL，分别与100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗，于温度37°C，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3_5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗-菌；4)免疫层析试纸条的制备:将样本垫用pH 8.5 0.IM Tris-HCl缓冲液(I %BSA，0.5%Tween-20)浸泡处理，置于60°C鼓风干燥箱，2h后取出备用；将大肠杆菌0157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为l-2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37°C真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡;将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；5)试纸条对样品的检测:将收集到的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗-菌稀释到50-150yg/mL，取10yL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；6)定性分析:用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有大肠杆菌0157:H7，T线不显色则说明样品中没有大肠杆菌0157:H7或是含有大肠杆菌0157:H7的量低于 103CFU/mL;7)定量分析:使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的大肠杆菌Ol 57: H7数量。所述步骤l)Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球粒径为80_210nm;步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴滤纸、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。使用大肠杆菌0157:H7Fe304/RU(bqy)32+纳米微球免疫层析试纸条，同时使用荧光读取仪定量检测的方法，其特征在于:配制已知系列浓度的大肠杆菌0157:H7溶液，用荧光读取仪测出其对应的荧光强度，根据这一系列数值与对应浓度建立标准曲线，然后将检测样品的试纸条放入荧光读取仪中，根据荧光读取仪输出的数值，查标准曲线图即可得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于包括以下步骤：1)纳米微球的制备：a.添加0.4‑0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2‑1.6mmol FeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80‑120℃，然后将3‑7mL 25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；b.取12mg Fe3O4纳米粒子用1‑10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3‑0.9mL的NH4OH溶液，再将10‑300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；c.把10‑300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1‑10mL去离子水和1mL0.5‑3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)32+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600‑900μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，用去离子水清洗备用；d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球；e.将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球；2)取0.5‑2mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至5‑10，加入0.05‑0.18mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及100‑500μg抗大肠杆菌O157：H7单抗，在温度37℃时，放在10‑15rpm的旋转仪上偶联60‑120min，磁分离3‑5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3‑5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5‑1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗；所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37 g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5‑6.0；所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；3)培养大肠杆菌O157：H7，将菌液调整浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100‑150μg Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗，于温度37℃，旋转仪转速10‑15rpm混合孵育30‑60min，孵育后磁分离3‑5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗‑菌；4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH 8.5 0.1M Tris‑HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween‑20)浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将大肠杆菌O157：H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1‑2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗‑菌稀释到50‑150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10‑15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有大肠杆菌O157：H7，T线不显色则说明样品中没有大肠杆菌O157：H7或是含有大肠杆菌O157：H7的量低于103CFU/mL；7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的大肠杆菌O157：H7数量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赖卫华，王景云，刘道峰，邓省亮，山珊，熊勇华，魏华，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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