本发明专利技术公开了一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，本发明专利技术通过筛选出4个泥鳅特有的微卫星SSR标记(2N18、2N19、4N7和4N17)和2个大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和PD50)，并同时结合1个已知可区分泥鳅和大鳞副泥鳅的线粒体标记(MP)和一种用鳍条进行泥鳅倍性检测的方法，建立了一个可鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅纯种和杂种的平台。这对泥鳅和大鳞副泥鳅繁育、选育和杂交育种等工作起着非常重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于水产生物技术领 域。
技术介绍
泥嫩（Misgurnus anguillicaudatus)和大鱗副泥嫩（Paramisgurnus dabryanus) 分别隶属于鲤形目鳅科中的泥鳅属和大鳞副泥鳅属。这两种鳅在我国分布广泛，除我国西 部高原外，自南至北均有分布。因有着较高的食用和药用价值，它们越来越受到消费者的喜 爱。近年来，随着市场需求量的不断增加，这两种鳅类的野生资源量下降严重，导致了它们 的市场价格节节攀升，其市场经济价值不可小觑。目前，国内已经掀起了一股泥鳅和大鳞副 泥鳅的养殖热潮，大规模的生产使得优良的泥鳅和大鳞副泥鳅苗种的需求量迅速增加。然 而，目前水产市场上泥鳅种质资源混杂，纯种与杂种难以分辨。如果使用育性较低的杂种作 为亲本，从繁育的角度来说，会直接造成繁育场巨大的经济损失。同时，鉴别出泥鳅和大鳞 副泥鳅的纯种和杂种，是开展这两种泥鳅选育和杂交育种工作的重要前提，这直接关乎到 育种工作的成功与否。 微卫星标记，又称简单序列重复（Simple sequence repeats，SSRs)，是目前为止 应用最为广泛的分子标记之一。其应用主要分为三个方向：遗传多样性研究、品种鉴定和亲 缘关系鉴定、以及遗传连锁图谱构建和QTL定位。线粒体DNA标记作为一种新型的分子工具， 拥有母系遗传的特点并且缺乏修复重组能力。泥鳅在我国存在多种染色体核型，以二倍体 和四倍体为主。因此，在进行泥鳅的繁育工作时，倍性鉴定一直是一个重要的内容，目前，人 们多利用血液进行泥鳅倍性检测，这对泥鳅的规格有一定的要求且对泥鳅也有一定的伤 害，如果能通过鳍条对泥鳅倍性进行判定，就能很好地解决上述的问题。 近年来，国内泥鳅种质资源混杂，市场上出现了大量的泥鳅和大鳞副泥鳅杂种。目 前，虽有通过外部形态、分子标记等对泥鳅和大鳞副泥鳅进行鉴别的方法，却至今没有泥鳅 与大鳞副泥鳅纯种和杂种的鉴别方法。为繁殖和培育出优良的泥鳅苗种，本专利技术旨在提供 。
技术实现思路
本专利技术针对目前泥鳅种质资源混杂、泥鳅与大鳞副泥鳅杂种大量出现的现状，提 供了一种能够鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法。 本专利技术包括:筛选出4个泥鳅特有的微卫星SSR标记（2价8、2附9、4阶和4价7)、2个 大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和TO50)和1个已知可区分泥鳅和大鳞副泥鳅的线 粒体标记(MP)，设计以上7个标记的引物，并用该引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩 增，获得PCR扩增产物并进行凝胶电泳分析。同时，本专利技术还用鳍条进行待测样品的倍性检 测，对倍性结果和凝胶电泳结果进行综合分析，从而鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种。 更加详细的方法如下： (1)取待测样本，剪取部分尾鳍组织，将尾鳍组织分成两份，一份黄豆大小的尾鳍 组织用于倍性检测；另一部分的尾鳍组织存放在装满95%乙醇的1.5ml的离心管中，采用醋 酸铵/异戊醇法提取基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA浓度，并将样品的质量浓度 稀释至100ngAiL，-20°C保存备用； (2)以步骤(1)中的黄豆大小的尾鳍组织为样本，利用倍性分析仪进行倍性检测； (3)以步骤（1)中的DNA为模版，以7个标记的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物， 然后进行凝胶电泳分析；所述7个标记的名称及其引物序列为： (4)对步骤(2)中获得的倍性结果和步骤（3)中获得的凝胶电泳结果进行综合分 析，二倍体的样本中，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是二倍体 泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ仅2个大鳞副泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本 是大鳞副泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况 下，线粒体标记的扩增产物为大小285bp条带的样本是二倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线 粒体标记的扩增产物为大小214bp条带的样本是大鳞副泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ三倍体的样 本中，在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒体标记的扩增产物为 大小285bp条带的样本是四倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线粒体标记的扩增产物为大小 214bp条带的样本是大鳞副泥鳅罕X四倍体泥鳅Λ四倍体的样本是四倍体泥鳅罕X四倍体 泥鳅Λ仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物。所述步骤(2)的倍性检测方法为:加200yL细胞核提取液在黄豆大小的尾鳍组织样 本上，刀片切割数次，然后加800yL细胞染色液，避光染色lmin，接着用30μηι滤网过滤，然后 用PBS定容至800yL上倍性分析仪检测倍性。步骤（3)中所述的PCR扩增的总体积为10yL，其中含lOOng/yL的模板DNA 0.5yL， 1 · OyL的 lOxBuffer，0 · 2yL的 10mmol/L dNTPs，0 · lyL的0 · 5IU/yL的Taq DNA聚合酶，lOnmol/ L正向及反向SSR引物各0.25yL，余量为双蒸水。步骤(3)中所述的PCR扩增的程序为:PCR循环参数为:94°C5min;然后30个循环，每 个循环包括94°C lmin，退火温度下30s，72°C lmin;最后72°C5min延伸;然后4°C保存。 步骤(3)中所述的凝胶电泳分析采用1.0 % -2.0 %的MetaPhor琼脂糖凝胶上电泳。 本专利技术与现有技术相比的优点： 本专利技术所阐述的方法是基于4个泥鳅特有的微卫星SSR标记（2N18、2N19、4N7和 4N17)、2个大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和PD50)、1个已知可区分泥鳅和大鳞副 泥鳅的线粒体标记(MP)、以及1种用鳍条进行泥鳅倍性检测的方法所建立的。利用本方法， 可高效且快速地对泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种进行鉴别，为解决目前泥鳅市场种质资源 混乱局面提供了一种准确快捷的鉴别方法。【附图说明】 图1为实施例一中随机选择的一条二倍体泥鳅纯种的倍性检测图。图2为实施例一的泥鳅特有的SSR标记4N7的PCR产物电泳检测部分结果，其中Μ为 DNA Mark I，DD1-DD5为二倍体泥鳅纯种样品，ΤΤ1-ΤΤ5为四倍体泥鳅纯种样品，ΡΡ1-ΡΡ5为 大鳞副泥鳅纯种样品，TP1-TP5为杂种TP样品，PT1-PT5为杂种PT样品。图3为实施例一中大鳞副泥鳅特有的SSR标记TO30的PCR产物电泳检测部分结果， 其中Μ为DNA Mark I，DD1-DD5为二倍体泥鳅纯种样品，TT1-TT5为四倍体泥鳅纯种样品， PP1-PP5为大鳞副泥鳅纯种样品。图4为实施例一中线粒体标记MP的PCR产物电泳检测部分结果，其中Μ为DNA Mark I，PD1-PD5为杂种ro样品，DP1-DP5为杂种DP样品。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述。 实施例一： 本实例所用的泥鳅与大鳞副泥鳅成鱼购买自湖北省武汉市白沙洲水当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取待测样本，剪取部分尾鳍组织，将尾鳍组织分成两份，一份黄豆大小的尾鳍组织用于倍性检测；另一部分的尾鳍组织存放在装满95％乙醇的1.5ml的离心管中，采用醋酸铵/异戊醇法提取基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA浓度，并将样品的质量浓度稀释至100ng/μL，‑20℃保存备用；(2)以步骤(1)中的黄豆大小的尾鳍组织为样本，利用倍性分析仪进行倍性检测；(3)以步骤(1)中的DNA为模版，以7个标记的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，然后进行凝胶电泳分析；所述7个标记的名称及其引物序列为：(4)对步骤(2)中获得的倍性结果和步骤(3)中获得的凝胶电泳结果进行综合分析，二倍体的样本中，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是二倍体泥鳅♀×二倍体泥鳅♂；仅2个大鳞副泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是大鳞副泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂；在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒体标记的扩增产物为大小285bp条带的样本是二倍体泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂，而线粒体标记的扩增产物为大小214bp条带的样本是大鳞副泥鳅♀×二倍体泥鳅♂；三倍体的样本中，在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒体标记的扩增产物为大小285bp条带的样本是四倍体泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂，而线粒体标记的扩增产物为大小214bp条带的样本是大鳞副泥鳅♀×四倍体泥鳅♂；四倍体的样本是四倍体泥鳅♀×四倍体泥鳅♂，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹小娟，彭鑫，徐秀文，王卫民，田先畅，徐佳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。