本发明专利技术公开了一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，该方法包括如下步骤：矮马基因组PCR文库创建；磁珠法进行微卫星序列筛选；矮马微卫星标记序列分类与验证。矮马基因组PCR文库创建时用获得的DNA片段作为模板，设计引物（5'-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。本发明专利技术能够快速、有效、大量的获得应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子遗传学
，具体涉及矮马的微卫星DNA标记技术。
技术介绍
微卫星是近十几年来发展起来的一种新的分子标记，它是指以少数几个核苷酸(1?6个)为单位多次重复的简单序列，其中以双核苷酸重复最为常见。应用于相关种群的遗传多样性检测和遗传图谱的构建。目前微卫星序列的获得主要有两种途径:一种是用经典的分子生物学方法构建富含有微卫星位点的基因组文库，通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆，但是筛选过程较复杂，筛选效率低，需要大量的人力和资金的投入;另一种是从已知的核酸序列中进行检索，但是可检索的资源相对有限。中国矮马是我国的珍稀濒危物种，对其遗传多样性的评价具有重要意义。目前，涉及矮马的微卫星分离制备方法还十分少见。因此，寻求新的矮马微卫星分离方法十分重要。目前本领域技术人员能够获知的比较相近的已公开技术主要有如下这些: 1、申请号号为01106477.3，名称为适用于猪品种分类的猪微卫星DNA标记的公开中国专利技术专利文献，该专利技术的特征是，构建部分小插入片段基因组文库，分离鉴定猪新微卫星标记，筛选其中适用于猪品种分类的猪微卫星标记HAU01、HAU02、HAU03，确定了该三个微卫星标记DNA顺序，设计了三个位点的引物。该专利技术为猪的品种分类、亲缘鉴定和标记辅助育种提供新的分子标记。2、申请号为201410022080.0，名称为草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法的中国公开专利文献，该专利技术利用微卫星标记与多重荧光PCR技术结合，筛选了 13个高度多态性微卫星位点，组建3个多重荧光PCR体系，通过测序仪分型，对草鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析;本专利技术的建立为草鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。以上这些这些技术的缺点是:应用多种内切酶共同切割基因组DNA的方法。此方法可以产生比较理想的片段，得到足够的侧翼序列来设计引物，但是如果用多酶切会产生不是平端的酶切产物，产物需要进行末端补平。
技术实现思路
本专利技术拟通过构建微卫星DNA文库、微卫星序列筛选、引物设计与优化和微卫星检测等步骤来实现来获得可靠的微卫星标记序列，为中国矮马的遗传多样性检测提供分子标记手段。本专利技术是这样实现的: ，该方法包括如下步骤: 步骤1:矮马基因组PCR文库创建； 步骤2:磁珠法进行微卫星序列筛选； 步骤3:矮马微卫星标记序列分类与验证。其中，步骤1中矮马基因组PCR文库创建包括如下步骤: 步骤1.1:矮马基因组DNA的提取； 步骤1.2:超声波破碎基因组DNA; 步骤1.3:根据目的片段的大小调整样本处理仪参数； 步骤1.4:超声波破碎后的DNA电泳检测； 步骤1.5:创建基因组PCR文库。步骤1.5中，用获得的DNA片段作为模板，设计引物(5’-G ATCGTCGACGGTACCGAATTC T;5，_G TCAAGAATTCGGTACCGTCGA C)，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。步骤2中磁珠法进行微卫星序列筛选包括如下步骤: 步骤2.1:用生物素标记的微卫星探针和Dynal磁珠与微卫星文库杂交； 步骤2.2:磁珠的平衡； 步骤2.3:磁珠吸附富集； 步骤2.4:捕获含有微卫星序列的单链DNA并进行PCR扩增； 步骤2.5:连接T-载体，克隆； 步骤2.6:原位杂交，用同位素探针进行二次筛选。步骤2.1采用以下方法实现:根据实验材料建立50HL反应体系，1.5μ?生物素标记的(CA)15 探针、5yL(50ymol/L)引物、15yL20XSSC、0.5yL10%SDS和 16yL ddH20，混合，68°C预热;将12nL (276ng)DNA95°C变性5min，加入预热的杂交混合液，68°C杂交lh;杂交过程中平衡磁珠。步骤2.4采用以下方法实现:用200μL0.1XTE在室温快速洗2次，加入50μL0.1 XTE 95°C变性10 min，释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用;PCR反应体系25nL，内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18nL，引物0.5灿，TaqDNA聚合酶0.5仙，根据DNA模板的浓度加入不多于4tiL的模板，加无菌水补足PCR仪进行扩增;反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，并浓缩到15仙左右，电泳检测。步骤2.5采用以下方法实现:建立lOyL连接反应体系:2 X连接酶缓冲液，pGEM-T vector lyL，插入DNA片段2yL，T4DNA连接酶lyL(3U/yL )，加无菌去离子水补足10μL，同时Τ载体自身连接作为对照，4°C连接过夜；用CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5a进行转化，得到微卫星基因组文库。步骤2.6采用以下方法实现:通过原位杂交对微卫星文库进行二次筛选;将转化所得的克隆转化到杂交膜上，同时保留完全相同大小的菌板，以待杂交结果出来后挑取阳性克隆；用同位素标记的(CA) 15进行杂交，压X光片，70°C放射自显影7d;挑取阳性克隆进行测序分析。步骤3中矮马微卫星标记序列分类与验证包括如下步骤: 步骤3.1:序列分类； 步骤3.2:微卫星标记序列的重复性、稳定性、多态性检验。本专利技术的技术效果是能够快速、有效、大量的获得应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记。此方法所获得的矮马微卫星标记还可应用于矮马遗传图谱的构建和其它分子生物学、分子生态学检测。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明，实施例中有关数量份数、百分比、数量比例等，若无特殊说明，均指质量单位。实施例1: 具体步骤如下: 一、矮马基因组PCR文库创建: 1、矮马基因组DNA的提取: 将5ml新鲜矮马血液或经EDTA抗凝的冷冻矮马血样(或肌肉组织)，应用基因组试剂盒提取基因组DNA，然后用分光光度计检测定量。2、超声波破碎基因组DNA: 将100yL、2 yg基因组DNA放入自动聚焦声波样本处理仪Covaris 220(美国Covaris公司)专用小玻璃管(520045)中，盖好备用。3、根据目的片段的大小调整样本处理仪参数: 目的片段为300?500bp之间，Covaris 220操作软件中参数设置如下:Duty factor10%,peak incident power 140 ff, Cycle per Brust 200,Tim 80 s.4、超声波破碎后的DNA电泳检测: 将破碎后的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，然后用凝胶成像系统进行观察分析，将峰值在300bp左右的DNA，用生物分析仪进行DNA破碎效果检测。 5、创建基因组PCR文库: 用获得的DNA片段作为模板，设计引物(5’-G ATCGTCGACGGTACCGAAT T C T;5’-G TCAAGAATTCGGTACCGTCGA C)，进行 PCR 扩增，创建基因组PCR文库。PCR反应体系为:94°C预变性3min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，30个循环，最后72°C延伸lOmin。反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应dNTP，并浓缩到15tiL左右。电泳检测。二、磁珠法进行微卫星序列筛选: 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：步骤1：矮马基因组PCR文库创建；步骤2：磁珠法进行微卫星序列筛选；步骤3：矮马微卫星标记序列分类与验证。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜林，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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