本发明专利技术公开了一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉及其应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015770，保藏日期：2015年12月23日。本发明专利技术首次从盐生植物海滨锦葵块根中分离出棘孢木霉，该棘孢木霉的ACC脱氨酶活性较高，能够通过降解乙烯合成前体，从而减少植物合成乙烯，间接提高生长素和乙烯的比例，促进植物的生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一株高产ACC脱氨酶的棘抱木霉及其应用，属于生物
技术介绍
内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细 菌。研究表明，内生菌的用途非常广泛，在农业生产方面，人们利用内生菌来增强其宿主的 抗逆性，抗虫害，促进植物的生长，增强宿主植物的环境适应能力，避免宿主受到迫害，运样 既减少了化学农药的大面积污染，又保证了农作物的天然性。在医学方面，从内生菌中寻找 更多抗癌和抗病的基因也成为现在的研究热点。在工业方面，内生菌产生的某些活性物质， 如具有抗性的特殊的酶类，在工业上也具有较大的应用潜力。 -般情况下，内生真菌与宿主是W互惠的方式进行共生，所W通常认为两者是互 利共生的关系。一方面，宿主植物为寄生的内生真菌提供生存环境和生长必须的养分;另一 方面，内生真菌会产生有利于宿主植物生长和发育的次级代谢产物，运些代谢产物在宿主 植物应对抗病虫害、抗旱和对病原体的括抗时发挥了重要作用。 迄今为止已被发现的内生真菌包括接合菌、卵菌、担子菌、子囊菌、有丝分裂抱子 真菌和其无抱菌等多种菌群，其中曲霉属、镶抱霉属和拟茎点霉属为较优势的菌种。而从耐 盐植物种直接分离棘抱木霉还属于空白。 植物在逆境下产生的大量逆境乙締阻碍其正常生长发育，严重时可导致植株死 亡。ACC脱氨酶可将植物乙締合成的直接前体ACC水解为α-酬下酸和氨，阻止植物内体乙締 的过量产生，有效促进逆境下植物的正常生长发育及延缓植物组织的衰老。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一株高产ACC脱氨酶的棘抱木霉及其应用，该 棘抱木霉具有很高的ACC脱氨酶活性，能够促进海滨锦葵和大豆幼苗的生长，增加其生物 量、含水量和叶绿素含量。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是提供一株高产ACC脱氨酶的棘抱 木霉，所述棘抱木霉为棘抱木霉(Trichoderma asperellunOKpS，保藏单位：中国典型培养 物保藏中屯、，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC N0:M 2015770,保藏日期： 2015年12月23日。[000引本专利技术所采用的技术方案还在于提供一种高产ACC脱氨酶的棘抱木霉的分离培养 方法，包括W下步骤： (1)将海滨锦葵块根去皮、消毒并切块，然后接种于PDA平板上培养，将培养出的菌 种进行分离纯化； (2)将分离纯化的菌种接种于PDA平板上，继续培养，挑选真菌并进行筛选； (3)将步骤(2)筛选的真菌进行基因组DNA提取，并连入T载体，转化大肠杆菌感受 态细胞，培养筛选单克隆，进行PCR检测并测序，得到棘抱木霉。 步骤(1)和(2)培养的溫度是25-28°C，时间是3-5d。 本专利技术所采用的技术方案还在于提供一种高产ACC脱氨酶的棘抱木霉在促进植物 生长方面的应用。 本专利技术有益效果 1、本专利技术首次从盐生植物海滨锦葵块根中分离出棘抱木霉，该棘抱木霉的ACC脱 氨酶活性较高，能够通过降解乙締合成前体，从而减少植物合成乙締，间接提高生长素和乙 締的比例，促进植物的生长。 2、本专利技术从海滨锦葵块根中分离内生真菌，并将分离纯化的内生真菌接种在ADF 平板上，筛选得到10种海滨锦葵内生真菌，通过高通量比色法和2,4-二硝基苯阱比色法，最 终筛选得到菌株KpS，结合显微镜观察菌落、抱子观察及测序结果，确认菌株KpS为棘抱木霉 (Trichoderma asperellum)。实验表明，本专利技术最终筛选的棘抱木霉KpS在ADF平板上的ACC 脱氨酶活性可达4557.9化Μ地Bmg-ih-i，高于其它几种海滨锦葵块根内生真菌，甚至是其中 绝大多数内生真菌的几倍甚至是十几倍。 3、本专利技术的棘抱木霉KpS接种海滨锦葵根系后，能够增强海滨锦葵的耐盐性，在高 盐条件下，显著提高海滨锦葵叶绿素含量，使海滨锦葵的叶片生长加快，叶片增厚，能够减 少水分蒸腾，提高幼苗的含水量，增加了海滨锦葵幼苗的干重和鲜重。[001引4、本专利技术克隆了棘抱木霉KpS的acdS基因，构建含有acdS基因的重组质粒，并电转 化毕赤酵母，最终在甲醇的诱导下利用毕赤酵母成功表达了 ACC脱氨酶，为利用酵母作为生 物反应器工业化生产ACC脱氨酶提供了技术支持。该技术通过生产ACC脱氨酶，利用ACC脱氨 酶增强植物的耐盐性。 5、本专利技术方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本专利技术原 料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。【附图说明】 W下结合附图对本专利技术的【具体实施方式】作进一步详细说明。 图1为海滨锦葵块根内生菌的ACC脱氨酶活性检测结果。 图2为菌株KpS的菌落形态图。 图3为菌株KpS的抱子形态图。 图4为菌株KpS的PCR扩增产物电泳图，图中，Μ为Marker，1为PCR扩增产物。 图5为棘抱木霉KpS对大豆幼苗生长影响的分析图。 图6为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗鲜重影响的分析图。 图7为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗干重影响的分析图。图8为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗含水量影响的分析图，图中，EF 为对照组，EI为菌处理组。 图9为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗叶绿色含量影响的分析图，图 中，EF为对照组，EI为菌处理组。 图10为棘抱木霉KpS的acdS基因的PCR扩增产物电泳图，图中，Μ为Marker, 1-3为 PCR扩增产物。 图11为目的基因 acdS、载体质粒PPIC9K和重组质粒pPIC9K-acdS的电泳图，图中，Μ 为Markera为载体质粒pPIC9K，2为重组质粒pPIC9K-acdS的双酶切，3为线性化的重组质粒 pPIC9K-acdS，4为目的基因 acdS。 图12为毕赤酵母转化子诱导表达产物电泳图，图中，Μ为Marker, 1、2、3、4、5分别为 毕赤酵母转化子在甲醇诱导12h、24h、4她、72h、96h的ACC脱氨酶表达量。 图13为毕赤酵母转化子在化C1浓度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板上的生长 情况，图中，a、b、c、d、e分别为化C1浓度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板，其中，A为转化 子A69，B为转化子B11，C为转化子B35，D为转化子B43，CK为未经转化的的毕赤酵母（阴性对 照)。 图14为毕赤酵母转化子在化C1浓度0 %、3%、6%、9%和12%的液体培养基中的生 长情况。【具体实施方式】 W下结合实施例对本专利技术的【具体实施方式】作进一步详细说明。 PDA平板:马铃馨洗净去皮，再称取200g马铃馨切成小块，加水煮烂，过滤，滤液加 20g琼脂，继续加热揽拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，揽拌均匀，再补足水分至 1000mL，12rC高压灭菌20min，铺平板，冷却即可。 DF无氮培养基（IL)Jg葡萄糖，地巧樣酸，4ml 50%葡萄糖酸溶液，0.2g MgS化· 7出0，0.1ml微量元素母液，0.1ml Mo〇3母液，0. lmlFeS〇4 · 7此0母液，定容至900ml超纯水， pH值调至7.2，121°C灭菌15min后，待冷却，加入100ml已灭菌的10 X憐酸盐母液。其中，[003引 微量元素母液（100ml):本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉，其特征在于，所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015770，保藏日期：2015年12月23日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭予琦，郭恒亮，张佳夜，席宇，汤颖颖，刘芳，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。