褐色橘蚜基因功能验证的方法技术

本发明专利技术公开了一种褐色橘蚜基因功能验证的方法，包括如下步骤：1)根据要抑制的目的基因合成相应的dsRNA溶液；2)用本发明专利技术方法将dsRNA溶液导入褐色橘蚜；3)培养结束后，收集褐色橘蚜虫体提取RNA，检测步骤1中的目的基因的表达情况。本发明专利技术方法设计新颖、操作简单、基因沉默效率高，基因干扰后有明显表型变化，研究应用成本低，解决了褐色橘蚜目前没有有效的dsRNA导入方法的问题，能够稳定而且有效地对褐色橘蚜进行RNA干扰，通过RNA干扰之后观察其表型，可以对褐色橘蚜目标基因所预测功能进行验证，探索研究新的害虫控制方法，本发明专利技术方法适用范围广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种褐色橘蚜基因功 能验证的方法。
技术介绍
褐色橘姐(Toxoptera citricida)是一种世界性的柑橘害虫，同时是柑橘衰退病 病毒的主要传播媒介，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗药性。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指 在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是 通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定 基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。同时，在农业害虫基 因功能的研究中，通过微量注射以及饲喂含有dsRNA的人工饲料是目前用于导入dsRNA最主 要的两种方法。然而，相比于一般昆虫个体更小的褐色橘蚜，如果想用微量注射的方法导入 dsRNA难度较大，目前还没有对褐色橘蚜导入dsRNA方面的报道。为了满足方便地研究褐色 橘蚜基因功能的需要，特别是为探索新的褐色橘蚜控制的有效方法，需要更好的褐色橘蚜 dsRNA导入的研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种褐色橘蚜基因功 能验证的方法。 本专利技术的技术方案如下： -种，包括如下步骤： 1)准备目的基因 dsRNA溶液:根据要抑制的目的基因合成相应的dsRNA溶液； 2)将步骤1)中的dsRNA溶液导入褐色橘蚜，操作方法包括如下步骤： a、取离心管，将离心管的底部剪去使得底部敞口，另取PCR管将管底剪掉使得底部 敞口，将PCR管的管底与离心管管盖的内壁粘在一起，使得PCR管套在离心管内； b、在PCR管中注入步骤1)制得的dsRNA溶液，将离心管管底朝上地竖立放置； c、取新鲜的柑橘嫩梢，插入PCR管中； d、将褐色橘蚜挑入离心管中，用纱网盖住离心管的管底，防止褐色橘蚜逃出离心 管，然后将离心管放入培养箱中培养48_72h。 3)培养结束后，收集褐色橘蚜虫体提取RNA，检测步骤1中的目的基因的表达情况。 作为优选地，所述的纱网为80目纱网。 作为优选地，所述的离心管为50mL离心管，所述的PCR管为250μ1 PCR管;步骤2)中 所述步骤d中，每个离心管中的褐色橘蚜头数为20 - 30头。 作为优选地，步骤2)中所述步骤d中，培养箱中的培养条件为25 ± 1°C、湿度75 土 5%、光照：黑暗为 12-14h:10-12h。 作为优选地，步骤3)中所述检测目的基因的表达情况的方法为：收集褐色橘蚜虫 体提取RNA，反转录得到相应的cDNA，然后以cDNA为模板利用qRT-PCR技术检测目的基因的 相对表达量验证抑制情况。 上述技术方案中，步骤1)中所述目的基因为褐色橘姐ABCG4基因，按照如下步骤制 备该基因的dsRNA溶液： 1)提取褐色橘蚜的总RNA，反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，利用上下游引物T7-ABCG4-S1和T7-ABCG4-A1进行PCR扩增，所述引物序列为： T7-ABCG4-S1： TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG； T7-ABCG4-A1： TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。 2)将步骤1中的PCR产物回收纯化之后作为合成dsRNA的转录模板，合成纯化得到 褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA溶液。上述技术方案中，步骤1)中所述目的基因为几丁质合成酶基因，按照如下步骤制 备该基因的dsRNA溶液： 1)提取褐色橘蚜的总RNA，反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，利用上下游引物T7- CHS-S1和T7-CHS-A1进行PCR扩增，所述引物序列为： T7-CHS-S1： TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTAAAAACTGAAGAC； T7-CHS-A1： TAATACGACTCACTATAGGGCGTCCATGAAAATGTGAGT。 2)将步骤1中的PCR产物回收纯化之后作为合成dsRNA的转录模板，合成纯化得到 褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA溶液。本专利技术的有益效果是:本专利技术方法设计新颖、操作简单、基因沉默效率高，基因干 扰后有明显表型变化，研究应用成本低，解决了褐色橘蚜目前没有有效的dsRNA导入方法的 问题，能够稳定而且有效地对褐色橘蚜进行RNA干扰，通过RNA干扰之后观察其表型，可以对 褐色橘蚜目标基因所预测功能进行验证，探索研究新的害虫控制方法。本专利技术方法适用范 围广，只需要根据不同目标基因设计特异性引物得到不同基因的dsRNA，均可以通过本专利技术 方法将相应的dsRNA导入褐色橘蚜，该方法还可广泛应用于与褐色橘蚜个体类似大小的其 他蚜虫。【附图说明】图1为本专利技术的饲喂dsRNA的装置。 图2为褐色橘蚜饲喂ABCG4基因的dsRNA后的ABCG4基因相对表达量，其中GFP表示 对照组，dsABCG4表示实验组。 图3为褐色橘蚜饲喂ABCG4基因的dsRNA后表型表现图；其中1为对照组的正常褐色 橘蚜，2为实验组的翅发育不正常的褐色橘蚜。 图4为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相对表达量，其中roS表示对照 组，dsTCiCHS表示实验组。图5为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积蜕皮率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。 图6为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积死亡率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。图7为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后表型表现图；其中1为实验组的不能正常蜕 皮死亡的褐色橘蚜，2为对照组的能够正常蜕皮的褐色橘蚜。【具体实施方式】本专利技术实施例所用化学试剂来源如下： RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司，德国） PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本） 胶回收纯化试剂盒(Takara公司，日本） Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific公司，美国） Perfect real time RT reagent(Takara公司，日本） G〇Taq_?qPCR Master Mix(Promega公司，美国） TranscriptAid Enzyme Mix(Thermo fisher Scientific公司，美国） ATP/CTP/GTP/uTP Mix(Thermo fisher Scientific公司，美国） PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific 公司，美国） Oligo dT Primer(The;rmo fisher Scientific公司，美国） Random 6 mers(Thermo fisher Scientific公司，美国） 实施例一、褐色橘姐ABCG4基因功能验证针对褐色橘姐AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种褐色橘蚜基因功能验证的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)准备目的基因dsRNA溶液：根据要抑制的目的基因合成相应的dsRNA溶液；2)将步骤1)中的dsRNA溶液导入褐色橘蚜，操作方法包括如下步骤：a、取离心管，将离心管的底部剪去使得底部敞口，另取PCR管将管底剪掉使得底部敞口，将PCR管的管底与离心管管盖的内壁粘在一起，使得PCR管套在离心管内；b、在PCR管中注入步骤1)制得的dsRNA溶液，将离心管管底朝上地竖立放置；c、取新鲜的柑橘嫩梢，插入PCR管中；d、将褐色橘蚜挑入离心管中，用纱网盖住离心管的管底，防止褐色橘蚜逃出离心管，然后将离心管放入培养箱中培养48‑72h。3)培养结束后，收集褐色橘蚜虫体提取RNA，检测步骤1中的目的基因的表达情况。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王进军，尚峰，丁碧月，熊英，魏冬，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85