从大豆中提取叶酸的方法技术

本发明专利技术属于植物提取物的制备领域，具体地涉及一种大豆种子中叶酸的提取方法。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。本发明专利技术提供了一种优化的从大豆种子中提取叶酸的方法，利用本方法，可以同时对上百个样品同时进行提取，使提取过程快捷高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物提取物的制备，具体地涉及一种大豆种子的提取和含量的测定方法。
技术介绍
叶酸是水溶性B维生素，叶酸缺乏会引起婴儿神经管缺陷、癌症和心血管疾病等严重的健康问题(Kimetal.,1998；Geisel,2003；Choi&Friso,2005；Marisaetal.,2005)。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。然而，在作物中叶酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何获得作物中各种叶酸衍生物含量的可靠数据是这一研究领域的关键问题。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。单酶法针对菠菜、黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶酸提取有效(Iwatanietal.,2003；Zhangetal.,2005)。三酶法对谷物类，土豆，豆类等的叶酸含量的提取效率高于单酶法，三酶法相对于单酶法能够更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基质的叶酸(DeSouza&Eitenmiller,1990；Tamuraetal,1997；Pffeiferetal,1997；Raderetal,1998；Aiso&Tamura,1998)。Hyun等(2005)研究的食物叶酸提取步骤，适量样品在提取液中研磨成匀浆，匀浆液分装后冻存于-70℃直至叶酸提取，加入蛋白酶处理样品后，100℃煮沸样品灭活蛋白酶，再利用α-淀粉酶和叶酸轭合酶共同孵育样品2小时，经离心后获取叶酸样品，与-70℃冻存样品。但是不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的(Aiso&Tamura,1998；Pandrangietal.,2004)，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。目前国内国际流行的作物中叶酸含量检测方法是微生物法和高效液相色谱法。高效液相色谱法利用C18色谱柱进行样品分离后，结合紫外吸收，荧光检测和电化学检测能够对单个叶酸组分进行定量分析。高效液相色谱法能够快速、高效地分离不同叶酸衍生物，样品用量少，但是该方法的灵敏度低于微生物法，而且内源叶酸会干扰叶酸测定，给某些形式的叶酸定量带来困难(Zhangetal.,2005；Póo-Prietoetal.,2006)。微生物法(MicrobiologicalAssay)是检测叶酸的经典方法，其原理是指示菌对叶酸的所有衍生物具有相同的生长反应速度，在一定条件下，微生物的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，根据微生物对样品中叶酸的吸收程度从而对叶酸进行定量(常娜宁等，2010)。酪乳酸杆菌对单谷氨酸叶酸、二或三谷氨酸叶酸及其还原型衍生物均敏感，是最为常用的菌种(Hyunetal.,2005)。叶酸分析中要求不同样品具有适当的稀释倍数，使用96孔酶标板对指示菌进行18-24h培养，并在分光光度计读取数值后计算样品中叶酸的含量。微生物法灵敏度高，结果准确，但重复性较差,而且只能检测总叶酸含量,但优点是不需要贵重的仪器或药品,所以成本较低,适用于大批量的样品检测。综上，有必要对大豆叶酸三酶法提取和微生物检测的方法进行优化，确定三种酶的最佳配比和微生物法检测的步骤，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。
技术实现思路
专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种大豆种子叶酸的提取和含量检测方法，旨在建立三酶法提取及微生物检测大豆种子中叶酸含量的方法，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。本专利技术用到的材料和仪器如下：一、材料和试剂常规药品为国产分析纯试剂；磷酸缓冲液(AMERESCO公司生产)；叶酸(Sigma公司)；α-淀粉酶(来源于米曲霉)和蛋白酶(来源于链霉素)(Sigma公司)；大鼠血清(中科晨宇(北京)贸易有限公司)；乳酸菌液体培养基和叶酸培养基购自北京鼎国生物技术有限公司；乳酸菌菌株购自北京中原合聚经贸有限公司；二、仪器与设备AXYGEN系列EP管(自经科宏达公司)；叶酸检测试剂盒(P1001)购自德国拜发生物有限公司；高通量组织研磨机SPEXGeno2000(美国SPEX公司生产)；3-30K高速台式冷冻离心机(德国SIGMA)；酶标仪(美国DynexMagellanBiosciences)。本专利技术提供了一种大豆种子叶酸的提取方法，包括以下步骤：(1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中，在样品中加入750μL叶酸提取缓冲液，95℃孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒)，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；(2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1h；100℃煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积比在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80℃，得大豆叶酸提取液。另外，根据本专利技术上述实施例大豆种子叶酸的提取方法还可以具有如下附加的技术特征：所述大豆样品制备步骤一中所述在组织研磨机中研磨的转速为1400rpm，时间为5min。所述大豆样品制备步骤一中所述研磨均需在避光条件下操作，大豆叶酸提取步骤均需在避光条件下操作。所述大豆样品制备步骤二中所述缓冲液的组分为pH值6.5的50mM磷酸缓冲液，加入1％的抗坏血酸钠盐，以及0.1％的2-巯基乙醇。本专利技术的第二个目的，是提供了一种大豆种子叶酸含量的测定方法，包括以下步骤：一、乳酸菌液体培养基的配制：将4.85g乳酸菌液体培养基加入100mL水中，121℃灭菌15min；二、低叶酸培养基的配制：称取4.7g叶酸培养基粉末、0.03g抗环血酸、0.3mL叶酸标准储配液，加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用；三、分析缓冲液的配制：称取Na2HPO4.2H2O0.38g、NaH2PO40.93g、抗环血酸1g加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用；四、叶酸培养基的配制：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸5min，过0.22μm滤膜灭菌备用；五、叶酸标准样品制备：称取28mg叶酸溶于4mL5％的K2HPO4溶液中，然后用分析缓冲液定容至250mL，再吸取0.5mL此溶液用步骤三制得的分析缓冲液定容至100本文档来自技高网...

【技术保护点】
从大豆中提取叶酸的方法，包括以下步骤：(1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGEN EP管中，在样品中加入750μL叶酸提取缓冲液，95℃孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒)，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；(2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8μLα‑淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1h；100℃煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积比在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于‑80℃，得大豆叶酸提取液。

【技术特征摘要】
1.从大豆中提取叶酸的方法，包括以下步骤：
(1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中，在样
品中加入750μL叶酸提取缓冲液，95℃孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒)，在组织
研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；
(2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液
以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1h；100℃煮沸10min，冰上迅速冷
却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积比在上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，孟繁磊，张原宇，王玉民，李海云，邢国杰，董英山，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22